Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen beskriver teknikker som brukes til å bestemme ion kanal strukturer av cryo-elektronmikroskop, inkludert en baculovirus å effektivt uttrykke genene i pattedyrceller med minimal innsats og toksisitet, protein utvinning, rensing, og kvalitet kontroll, prøve rutenettet forberedelse og screening, samt innsamling og behandling.
Transcript
Denne protokollen gjorde oss i stand til å løse strukturen til menneskelig TRPC3, et medlem av en viktig, men understudert familie av ionkanaler. Den største fordelen med denne teknikken er den høye effektiviteten som den kan brukes til å uttrykke og rense en rekke proteiner, for både strukturelle og funksjonelle studier. Denne metoden kan gi et effektivt proteinuttrykk og rensingssystem, for bruk i å studere proteinbiokjemi og biofysikk og kan brukes på et bredt spekter av iionkanaler og andre membranproteiner.
Først kontrollerer du det relative virusuttrykket ved å se GFP-fluorescensen av viruset i en prøve av viruset som produserer kultur. I en forvirret bunn Erlenmeyer kultur kolbe av tilstrekkelig størrelse, forberede et ønskelig volum av en HEK293 pattedyr celle suspensjon kultur, med en konsentrasjon på 3,5 til 3,8 millioner celler per milliliter i uttrykksmediet, supplert med 1% steril FBS. Tilsett 8% i volum av forberedt P2 virus lager løsning og inkubere i en Orbital Shaker på 37 grader Celsius og 135 RPM.
Ved 12 til 18 timer etter infeksjon legge 10 millimolar natrium butyrat, inkubere ved 30 grader Celsius for den tiden som er nødvendig for optimal proteinuttrykk. Etter dette, sentrifuge på 2, 880 ganger tyngdekraften i 20 minutter for å høste cellene. Vask og gjenbruk cellene i ca 100 milliliter TBS per liter celler høstet.
Sentrifuge igjen på 2, 880 ganger tyngdekraften i 20 minutter og samle cellepellet. Samle også små, en milliliter celle pellet avlinger på varierende tidspunkter og løse i to timer ved fire grader Celsius med agitasjon i nærvær av forskjellige vaskemidler og / eller tilsetningsstoffer. Avklare disse små hele cellen solubiliserte prøver ved ultracentrifugation på 235,000 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 10 minutter.
Deretter kjører du dem som 30 mikrolitersprøver på en SEC-kromatografikolonne, for å bestemme den beste tiden for uttrykk og de beste solubiliseringsforholdene. Tin pelleten i 100 milliliter buffer per liter celler høstet. Når cellene er tint, pipette eller rør dem for å sikre at løsningen er homogen.
La cellene løse ved fire grader Celsius i et beger nedsenket i is i to timer mens de blir rørt av en rørestang. Deretter fjerner du eventuelle cellerus ved ultracentrifugation ved 235 000 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i en time. Kjør en 30 mikroliter prøve av supernatant på en SCC-kolonne av HPLC for å bekrefte proteinmengden og visualisere målproteinet ved GFB signalutgang.
Påfør kobolt affinitet harpiks bundet supernatant som inneholder det solubiliserte proteinet til en tyngdekraftkolonne og samle gjennomstrømningen. Kjør en 30 mikroliter prøve av gjennomstrømningen på en SCC-kolonne for å kontrollere at proteinet er bindende til harpiksen. Vask deretter harpiksen med 10 kolonnevolumer buffer.
Kjør en 30 mikroliter prøve av vasken på en SCC-kolonne for å se etter proteintap. Bruk buffer, elute harpiks bundet menneskelig TRPC3. Kjør en 90 mikroliters prøve av eluanten som har blitt fortynnet en til 100 på en SSC-kolonne for å kontrollere at proteinet er eluted og for å verifisere tilstedeværelsen av et GFP-signal i posisjonen som tilsvarer målproteinstørrelsen.
Tilsett Thrombin med ett til 20 molarforhold og tilsett 10 millimolar EDTA til den eluterte prøven. Inkuber ved fire grader Celsius i tre timer. Etter dette, overføre eluanten til en 15 milliliter sentrifugal filterrør.
Spinn røret på 2, 800 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i fem minutters intervaller for å konsentrere eluant til 500 mikroliter eller mindre. Pipette proteinoppløsningen opp og ned mellom spinn for å gjenbruke proteinet og forhindre overkonsentrering. Last konsentratet på en SSC-kolonne i buffer.
Kjør rask protein flytende kromatografi og samle 300 mikroliter fraksjoner. Deretter kombinerer du toppfraksjonene som inneholder TRPC3 tetramer som visualisert av UV-absorbanssignalet. Og konsentrere seg igjen til en endelig konsentrasjon på minst fem milligram per milliliter.
Den menneskelige TRPC3 er hele cellen solubilisert i en rekke vaskemidler med en kritisk micelle konsentrasjon på 0,01 til 20 mikromolars, og ble kjørt i en DDM / CHS som inneholder buffer. Selv om DDM/CHS viser den høyeste løseligheten av menneskelig TRPC3, Toppposisjonen ser for stor ut til å være tetramerisk menneskelig TRPC3. Etter at hele celler solubilisering cellen lysis rusk er fjernet og den løse protein er lastet på en SSC kolonne og kjøre på HPLC i DDM / CHS vaskemiddel som inneholder buffer, for å sammenligne den absolutte løselighet og toppvolum av menneskelig TRPC3 under forskjellige forhold i forhold til en TRPM4 kontroll.
Alle de forskjellige vaskemiddelsluktede TRPC3-prøvene viser toppposisjoner rundt 11,9 milliliter som sannsynligvis er for store fordi den tetrameriske formen for menneskelig TRPC3 har en mindre molekylvekt enn den positive menneskelige kontrollen TRPM4. To forskjellige solubiliserings- og kjørebuffere som inneholder DDM/CHS og digitonin, testes deretter. Proteinet som kjøres i buffer som inneholder digitonin gir den høyeste toppen i en rimelig posisjon i forhold til den positive kontrollen.
Mens en liten skala rensing ved hjelp av 25 milliliter celler viser flere brede topper, proteinet viser funksjonene i en enkelt tetrameric menneskelig TRPC3 kanal i 2D klassifisering av negativ-flekk. Tilsetningsstoffer blir deretter screenet basert på den fysiologiske karakteren til menneskelig TRPC3. EDTA viser en bemerkelsesverdig innvirkning på å stabilisere menneskelig TRPC3 i en intakt tetramerisk toppposisjon og betydelig økt antall partikler i kryo-EM-mikrografen og reduserte støyen i bakgrunnen.
Kvaliteten på de endelige resultatene avhenger av god feilsøking av FSCC-profilene på HPLC. Og på å fullføre alle rensetrinnene raskt, ideelt sett på en enkelt dag. Strukturell bestemmelse, antistoffgenerering og funksjonelle studier som bindende analyser eller elektrofysiologi kan utføres etter denne prosedyren.
Denne teknikken kan og har blitt tilpasset for å studere andre iionkanaler og proteinfamilier og å produsere rensede proteiner for applikasjoner utover strukturell bestemmelse. De nødvendige forholdsregler for håndtering av cellekultur biohazards som å jobbe i en laminær strømningshette, iført verneklær, og riktig avhending av avfall, bør tas.
Tags
Biokjemi problemet 143 Ion kanal membran proteiner protein rensing proteinstrukturer cryo-elektronmikroskop cryo-EM baculovirusRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
