Neuroscience
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利用可活性可选位的激光光致发光体研究小鼠脑片中的烟碱乙酰胆碱受体功能
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Summary January 25th, 2019
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本文提出了一种用烟碱不加污染的方法研究小鼠脑片中烟碱乙酰胆碱受体 (nachr)。当与同时膜片钳记录和 2-光子激光扫描显微镜, 尼古丁发现连接烟碱受体功能与细胞形态, 提供了更深入的了解胆碱能神经生物学。
Transcript
该技术利用多光子激光扫描显微镜与光激活尼古丁分子的激光闪光光解结合。允许准确激活烟酸胆碱受体。该技术允许对烟酸受体激动剂应用进行精细的时空控制，为研究受体功能表达模式和胆碱性突触或体积传输提供了强大的工具。
在开始该步骤之前，使用可编程移液器拉拔器拉取直径为 20 至 40 微米的玻璃微管。通过 0.22 微米过滤器对大约 1 毫升的记录溶液进行应变。并在过滤的录音溶液中重新暂停足够的冻干光活性尼古丁，以产生两毫升的最终浓度。
用可光激活药物的 50 微升回填拉本地应用微移液器，将移液器固定到安装在微操纵器上的移液器支架中。通过适当长度的管道将移液器支架连接到能够持续低压应用的压力喷射系统。并使用微操纵器将局部应用移液器操纵到细胞外记录解决方案中。
将移液器尖端略高于小鼠脑组织样本，距离感兴趣的细胞约 50 微米。并短暂地对移液器施加每平方英寸一到两磅的压力。感兴趣的单元格应最小或无位移。
实现稳定的全细胞贴片夹后，打开压力喷射装置的低应用，用光激活尼古丁使细胞周围的组织饱和一到两分钟。本地应用程序为实验引入了额外的复杂性。但它可避免化合物，并允许使用更高浓度的PA-Nic。
对于光活性尼古丁的沐浴应用，首先在适合连续循环至100微摩尔最终浓度的录音溶液中溶解足够的冻干药物。将产生的混合物装入灌注系统中。然后以每分钟 1.5 至 2 毫米的速度开始重新循环可光激活尼古丁溶液，使用内径最小和总长度的管材，以最大限度地减少所需的再循环体积。
在再循环过程中，用碳原连续泡泡溶液，并在低光条件下将浴池温度保持在32摄氏度。沐浴应用受益于PA-Nic组织渗透的简单性和均匀性。但它必然利用较低的微摩尔PA-Nic浓度，并消耗更高的化合物总量。
要实时可视化中端哈贝努拉神经元，请使用透光或红外差分干扰对比度光学元件和摄像机建立稳定的全细胞贴片夹记录。建立高电阻单元连接配置后，但在闯入之前，将设置和软件切换到激光扫描模式。闯入后，使用激光扫描验证感兴趣的成像染料是否通过扩散被动填充神经元。
在使用实时扫描功能可视化感兴趣的神经元和亚细胞隔间之前，让染料填充细胞隔间至少 20 到 30 分钟。选择成像参数，允许对神经元特征进行精确的实时可视化，并操纵适当的设置以影响或更改显示可视化、分辨率、信噪比和图像帧采集时间。要增强信号对比度，请打开查找表窗口并调整查找表地板和天花板设置。
要定位组织内感兴趣的区域，请选择 1 倍光学变焦并使用平移控件。使用 Z 系列工具选择包含感兴趣单元格的开始和停止位置。设置一微米的步长，并选择将产生最高分辨率图像的图像大小。
通常为 1，024 x 1，024 像素/行。然后连续成像包含细胞的每个 Z 平面中的神经元。要校准激光刺激，请使用大于最小值的成像激光功率启动系统扫描，并微调目标焦点到细红色标记荧光层。
选择荧光场内无碎屑且均匀涂有标记的区域，然后打开工具、校准和对齐菜单，选择未清除的封发功能。按照燃烧点教程进行第二个电表镜对的空间校准，选择 405 纳米激光、400 的激光刺激功率和 20 毫秒的刺激持续时间。在红色标记上产生直径一到五微米的孔。
选择更新以刺激和刷新中心点刻录后的图像，然后将圆形红色指示器移动到中心、右中心点和下中心点的实际位置，以获取九个点的网格。要测试校准，请打开标记点窗口，然后手动激活样品新区域中已定义点的刺激参数，注意将正确的最新校准文件加载到标记点窗口中。然后应用测试脉冲以验证正确的校准。
要简要成像和定位感兴趣的子细胞区域，请选择实时扫描并使用增加光学变焦以可根据需要可视化任何小结构。将标记点单点十字线紧邻细胞膜，将光照参数设置为 1 到 50 毫秒的持续时间、1 到 4 毫瓦的激光功率和至少一次试验。然后选择运行标记点启动标记点协议，并实时观察电生理数据采集。
如证明，在从局部应用移液器喷射压力时，很容易检测到可光激活的尼古丁 2PE 荧光一毫摩尔 PA-Nic。而光活性尼古丁光解反应的主要光化学产品的输送，在相同的浓度和激发功率和波长下不会产生荧光信号。展示可照片激活尼古丁结果的特异性。
如证明，对应用于脑组织的光活性尼古丁进行成像，可显示药物在局部应用移液器的 100 到 200 微米范围内存在。确认可光激活的尼古丁可以通过局部应用有效地传递到脑组织。在这里，显示神经元形态学似乎完整的高质量图像，将噪声降至最低，并且碎片不干扰对细胞形态的解释。
然而，这些图像的质量较低。由于信号与背景比率较低，碎片大量。如演示，将脑片中基哈贝努拉神经元的两光子激光扫描显微镜与PA-Nic的激光闪光光解配对，可使电生理反应与细胞形态进行协调。
以 10 秒间隔执行的单点光解允许基线保持电流的足够恢复时间。而较短的一秒间隔会导致随着协议的进行，保持电流逐渐增加。暗示尼古丁没有足够的时间以较短的间隔从系统中扩散出去。
在设计利用光活性分子的实验时，重要的是要记住选择荧光指标，并报告具有兼容激发发射光谱的荧光团。PA-Nic 由于其短波长光解峰值，与最常见的荧光团兼容。在选择最合适的PA-Nic应用技术时，必须仔细考虑感兴趣的神经元中尼古丁受体的功能表达、生理活性。
熟练地利用这种技术，可以精细地控制尼古丁的应用，从而为研究原生尼古丁受体啮合、亚细胞定位和通过尼古丁受体激活调整神经元活性的动力学提供了令人兴奋的新可能性。
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