Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Использование в качестве средства для пищевыми инфекциями в Zebrafish личинки Протозойные Парамеции туфелька
Chapters
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Данио рерио (Danio рерио) становятся широко используется позвоночных животных модель микробная колонизация и патогенеза. Этот протокол описывает использование простейших Парамеции туфелька в качестве инструмента для пищевого инфекции данио рерио личинки. P. туфелька легко усваивает бактерий и получить принятые личиночной данио рерио через естественное поведение хищными.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии о динамике колонизации и инфекции микроорганизмами в желудочно-кишечном тракте. Основными преимуществами этого метода является то, что он является более репрезентативным пищевых инфекций в организме человека и что он уменьшает потенциальные повреждения тканей у рыб по сравнению с устные gavage. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как мытье шаги могут быть трудно выполнить из-за очень пестрый характер парамеции.
Из живой растущей культуры добавьте один миллилитр культуры парамеция и один миллилитр культуры электронной палочки MG1655 в десятимильной ткани культуры колбы, содержащей восемь миллилитров E3 среды. Слегка закружить колбу, прежде чем поместить его на 22 градусов по Цельсию проходит один миллилитр совместной культуры в новые десять миллилитров ткани культуры колбу, содержащую девять миллилитров свежих E3 среды, дополненный 108 колонии формирования единиц на миллилитр электронной палочки MG1655, каждые две недели. Чтобы определить бактериальный полуинсия в парамеции рассчитывать количество парамеции от оптической плотности 600 бактерий парамеции совместно культуры и добавить 50 микролитр aliquot супернатанта к новой 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки каждый час в течение шести часов.
Добавьте 950 микролитров одного процента неионных сурфактантов в PBS в трубки. И вынизывают парамецию в каждом образце с одной минутой вихря, а затем сделать один из десяти разбавления каждого образца в стерильных PBS. И пластины 100 микролитров каждого разбавления на селективные пластины в течение 16 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день, рассчитывать только изолированные и различные отдельные колонии, чтобы определить количество бактериальных колоний на пластине. И определить пластину с разбавлением, которое дает 30-300 колоний-образующих единиц. За день до заражения, собирать один объем бактерий из оптической плотности 600 культуры на лечение центрифугации.
И повторно приостановить гранулы в один миллилитр E3 среды на трубку. Далее добавьте один микролитер соответствующего бактериального пятна к каждой бактериальной суспензии. И защитить трубки фото отбеливания с фольгой.
Перед инкубацией образцов бактерий с окончанием вращения в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть бактерии два раза в большом объеме E3 среды, чтобы удалить избыток красителя. И повторно приостановить гранулы в один миллилитр свежей E3 среды на трубку.
Затем добавьте один миллилитр бактериальной суспензии к каждой из двух колб свежей парамеции на состояние в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. Потяните содержимое обеих колб в состоянии в отдельные 50 миллилитров конических труб. И гранулировать образцы центрифугой.
Используя стерилогическую пипетку, замените примерно десять миллилитров супернатанта E3 в каждой трубке десятью миллилитров свежей среды E3 для 3 омывает центрифугированием. После последней стирки удалите около десяти миллилитров супернатантов E3, заботясь о том, чтобы не нарушить гранулы, и повторно приостанавливайте гранулы в оставшихся десяти миллилитров E3 среды. Передача 500 микролитров каждой подвески в отдельные 1,5 миллилитр микроценрифуги труб и гранулы парамеции центрифугации.
Отбросьте 400 микролитров супернатантов и добавьте 20 микролитров 36,5-процентного раствора формальдегида к оставшимся 100 микролитерам парамеции с нежной пипетки. После пяти минут при комнатной температуре, измерить фактический общий объем в каждой трубке по пипетке, прежде чем считать количество мертвых парамеции на миллилитр. Для пищевой инфекции зебры, разбавить образцы парамеции в два раза десять до пяти парамеции на миллилитр средней концентрации E3.
И добавить 3 миллилитров каждой культуры парамеции к одному колодец из 6 хорошо пластины в состоянии. Затем перенесите десять обезболиированных зебры в каждую колодец в минимальном объеме жидкости. И инкубировать со-культуры в течение двух часов при 30 градусах по Цельсию в дневном инкубаторе в условиях дневного света.
Чтобы определить скорость добычи, просмотрите кормление зебры под стерео микроскопом, приобретая видеозапись захвата добычи. Захват добычи характеризуется ударом зебры к добыче. Каждый удар оценивается как одно событие захвата добычи.
В конце инкубации, мыть зебры в 5 различных скважин, содержащих 3 миллилитров свежей E3 среды дополняется 100 миллиграммов на литр трикаина на скважину. И вставлять каждый зебры в 3 миллилитров 1 процент низкорастух агарозы в черный welled шесть пластины хорошо. Когда все рыбы были встроены, поместите пластину под стерео микроскопом и использовать обрезанный гель загрузки отзыв, чтобы убедиться, что головы находятся слева и хвосты находятся справа в каждом поле просмотра.
Подождите 5 минут для агарозы установить, а затем наложить встроенные рыбы со свежим E3 среды дополняется трикаин, и изображение зебры на флуоресцентный микроскоп для оценки прогресса бактериальных инфекций. Для патогенной электронной палочки, начальная бактериальная плотность составляет 790 бактерий на парамеция, и бактерии деградируют в вакуолах каждого атома парамеция с половиной жизни около 2,3 часа. Добыча сопровождается характерным поразительным поведением, а определение скорости добычи основано на предположении, что каждый удар приводит к интернализации 1 парамеция.
После переваривания, свободные бактерии перемещаются от foregut к середине и задней кишки, где они обнаруживаются примерно через 1 до 2 часов после начала охоты. S-enterica, например, локализуется в основном в кишечных слизистых оболочках с некоторым эпителиальным вторжением, ведущим к проникновению нейтрофилов в эпителий. Не забывайте, что работа с определенными типами бактерий может быть чрезвычайно опасным, и что меры предосторожности, такие как ношение надлежащего средства индивидуальной защиты всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
