Utilizando el protozoo Paramecium caudatum como un vehículo para las infecciones transmitidas por los alimentos en las larvas de pez cebra

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología sobre la dinámica de colonización e infección por microorganismos en el tracto gastrointestinal. Las principales ventajas de esta técnica son que es más representativa de las infecciones transmitidas por los alimentos en los seres humanos y que reduce el daño potencial de los tejidos en los peces en comparación con el gavage oral. La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos de lavado pueden ser difíciles de realizar debido a la naturaleza altamente móvil de la paramecia.

De un cultivo en vivo, agregue un mililitro de cultivo de paramecio y un mililitro de un cultivo de e-coli MG1655 a un matraz de cultivo de tejido de diez mililitros que contenga ocho mililitros de medio E3. Gire ligeramente el matraz antes de colocarlo a 22 grados Centígrados pasando un mililitro del co-cultivo en un nuevo matraz de cultivo de tejido de diez mililitros que contenga nueve mililitros de medio E3 fresco, complementado con 108 unidades formadoras de colonias por mililitro de e-coli MG1655, cada dos semanas. Para determinar la vida media bacteriana dentro de un paramemio contar el número de paramecia de una densidad óptica de 600 bacterias paramecia co-cultivo y añadir una alícuota de 50 microlitrados de sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros cada hora durante seis horas.

Agregue 950 microlitros de un tensioactivo no iónico del uno por ciento en PBS a los tubos. Y lice la paramecia en cada muestra con un minuto de vórtice, luego haga una de cada diez diluciones de cada muestra en PBS estéril. Y placa 100 microlitros de cada dilución en placas selectivas para una incubación de 16 horas a 37 grados Celsius.

Al día siguiente, cuente sólo las colonias individuales aisladas y distintas para determinar el número de colonias bacterianas en la placa. E identificar una placa con una dilución que produce 30-300 unidades formadoras de colonias. El día antes de la infección, recoger un volumen de bacterias de una densidad óptica de 600 cultivo por tratamiento por centrifugación.

Y vuelva a suspender los pellets en un mililitro de E3 medio por tubo. A continuación, agregue un microlitro de una mancha bacteriana adecuada a cada suspensión bacteriana. Y proteger los tubos foto blanqueo con papel de aluminio.

Antes de incubar las muestras de bacterias con rotación final sobre el extremo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las bacterias dos veces en un gran volumen de E3 medio para eliminar el exceso de tinte. Y vuelva a suspender los pellets en un mililitro de medio E3 fresco por tubo.

A continuación, añadir un mililitro de suspensión bacteriana a cada uno de los dos matraces de paramecia fresca por condición durante una incubación de dos horas a temperatura ambiente. Tire del contenido de ambos matraces por condición en tubos cónicos individuales de 50 mililitros. Y pele las muestras por centrifugación.

Usando una pipeta esterílógica, sustituya aproximadamente diez mililitros del sobrenadante E3 en cada tubo por diez mililitros de E3 medio fresco para 3 lavados por centrifugación. Después del último lavado, retire aproximadamente diez mililitros de los sobrenadantes E3, teniendo cuidado de no interrumpir los pellets, y vuelva a suspender los pellets en los diez mililitros restantes del medio E3. Transfiera 500 microlitros de cada suspensión a tubos individuales de microcenrifugación de 1,5 mililitros y pele la paramecia por centrifugación.

Deseche 400 microlitros de los sobrenadantes y agregue 20 microlitros de 36,5 por ciento de solución de formaldehído a los 100 microlitros restantes de paramecia con pipeteo suave. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, mida el volumen total real en cada tubo por pipeta antes de contar el número de paramecia muerta por mililitro. Para la infección transmitida por alimentos del pez cebra, diluir las muestras de paramecia a dos veces diez a cinco paramecia por mililitro de concentración media E3.

Y añadir 3 mililitros de cada cultivo de paramecia a un pozo de una placa de 6 pozos por condición. A continuación, transfiera diez peces cebra anestesiados a cada pozo en un volumen mínimo de líquido. E incubar los co-cultivos durante dos horas a 30 grados celsius en una incubadora diurna bajo condiciones de luz diurna.

Para determinar la velocidad de presa, vea el pez cebra de alimentación bajo un microscopio estéreo mientras adquiere imágenes de vídeo de la captura de presas. La captura de presas se caracteriza por el golpe de un pez cebra hacia la presa. Se estima que cada golpe es un evento de captura de presas.

Al final de la incubación, lavar el pez cebra en 5 pozos diferentes que contienen 3 mililitros de medio E3 fresco complementado con 100 miligramos por litro de tricaína por pozo. E incrustar cada pez cebra en 3 mililitros de 1 por ciento de baja fusión de agarosa en un plato negro de seis pozos. Cuando todos los peces se hayan incrustado, coloque la placa debajo de un microscopio estéreo y utilice una punta de carga de gel recortada para asegurarse de que las cabezas están a la izquierda y las colas están a la derecha en cada campo de visualización.

Espere 5 minutos para que la agaria se ajuste, luego superponga el pescado incrustado con medio E3 fresco complementado con tricaína, e imagine el pez cebra en un microscopio fluorescente para evaluar el progreso de las infecciones bacterianas. Para la e-coli patógena, la densidad bacteriana inicial es de 790 bacterias por paramecio, y las bacterias se degradan dentro de las vacuolas de cada átomo cortado de paramemio con una vida media de aproximadamente 2,3 horas. La presa va acompañada de un comportamiento llamativo característico, y la determinación de la tasa de presa se basa en la suposición de que cada golpe conduce a la internalización de 1 paramecio.

Después de la digestión, las bacterias libres se mueven desde el foregut hasta el intestino medio y posterior, donde se detectan aproximadamente 1 a 2 horas después del comienzo de las presas. S-enterica, por ejemplo, localiza principalmente en la mucosa intestinal con alguna invasión epitelial que conduce a la infiltración de neutrófilos en el epitelio. No olvide que trabajar con ciertos tipos de bacterias puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como usar el equipo de protección personal adecuado durante la realización de este procedimiento.