Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren
Chapters
Summary June 6th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit protocol beschrijft een cel Sorteren gebaseerde methode voor de zuivering en cultuur van fluorescerende erge of glutamaterge neuronen uit de neocortex en Hippocampus van postnatale muizen of ratten.
Transcript
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het zuiveren en kweken van specifieke soorten primaire neuron. Deze culturen zijn geschikt voor elektrofysiologische, morfologische en overlevingsanalyse. Culturen van gezuiverde neuronen kunnen worden gebruikt om fundamenten van neuronale fysiologie, vorming van synapsen en hoe neuronale netwerken zich ontwikkelen te bestuderen.
Terwijl we ons richten op corticale glutamatergic hoofdcellen en GABAergic interneurons, kan deze procedure gemakkelijk worden aangepast om alle neuronale lijnen te bestuderen die fluorescerende eiwitten uitdrukken. Om glazen coverslips voor te bereiden, ontdooi je eerst een vijf milliliter aliquot van 200 microgram per milliliter PLL-oplossing. Verdun deze voorraadoplossing tot 20 microgram per milliliter door 45 milliliter zuiver injectiewater toe te voegen.
Filter vervolgens de oplossing in een nieuwe conische buis van 50 milliliter en label deze buis als PLL steriel. Plaats vervolgens 100 steriele ronde 12 millimeter glazen coverslips in de steriele PLL-oplossing. Roer de buis om de vijf tot tien minuten gedurende twee tot drie minuten om een gelijkmatige coating te garanderen.
Na 40 minuten PLL-coating, neem twee stukken tissuepapier en leg ze plat in de flow cabinet. Steriliseren het papier met behulp van 70%-ethanol dan plat om kreukels te verwijderen en laat drogen. Na het coaten van de glazen coverslips gedurende een uur met PLL, verwijder overtollige PLL-oplossing en voeg steriel injectiekwaliteit water toe.
Roer de covers twee tot drie seconden voorzichtig om overtollige PLL te verwijderen. Herhaal deze spoelstap nog twee keer. Verwijder overtollig water en breng de coverslips over naar het steriele tissuepapier.
Zodra droog, breng de coverslips naar een 24 goed cultuur plaat. Om de celkweekoplossingen voor te bereiden, meet u 12 milliliter celkweekbuffer tot een conische buis van 15 milliliter en label als BSA. Meet vijf milliliter celcultuurbuffer tot een andere 15 milliliter buis en label als papaïne.
Vervolgens, incubeer beide buizen gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius. Voeg 120 milligram BSA toe aan de buis met het label BSA. Keer vervolgens de buis om om de oplossing op te lossen.
Voeg vervolgens zeven milligram papaïne toe aan de buis met het label papaïne. Breng beide buizen 15 minuten terug naar het waterbad. Filter de BSA-oplossing in een verse conische buis.
Verdeel de steriele BSA-oplossing in drie buizen en label elke buis als BSA-steriel en één, twee of drie. Filter nu de papaïnebuis steriliseren en label de buis als papaïne steriel. Breng alle buizen terug naar het waterbad en blijf tot gebruik uitbroeden bij 37 graden Celsius.
Om voor te bereiden op weefseldissectie, lay-out van de scalpel, schaar, tangen, en spatel die nodig zijn voor de dissectie van de hippocampus en cortex. Plaats twee petrischaaltjes van 35 millimeter en een petrischaaltje van 100 millimeter met steriel filterpapier in de stroomkast. Verzamel transgene NexCre; Ai9 of vesiculaire GABA transporter Venus muis pups die moeten worden ontleed met behulp van een tl-lamp met de juiste excitatie en emissiefilters te discrimineren fluorescerende pups van wilde type liter stuurlieden.
Onmiddellijk voor het ontleden van de dieren, vul elke petrischaal met gekoelde steriele cel cultuur buffer. Breng na ontleding de hersenen van de transgene pup voorzichtig over naar een steriel filterpapier. Ontleden eerst het cerebellum en scheid de twee hemisferen.
Scheid vervolgens zorgvuldig de hippocampus en cortex van elke hemisfeer. Breng het ontleed weefsel naar een 35 millimeter petrischaal met gekoelde celkweekbuffer. Breng vervolgens de ontleede hippocampus en cortex over naar het deksel van nog eens 35 millimeter petrischaaltje.
Met behulp van de vlakke rand van een scalpel mes, zorgvuldig hak het weefsel in een kriskras beweging totdat alleen kleine stukjes overblijven. Breng vervolgens het gehakte weefsel met een kleine hoeveelheid papaïne-oplossing van het petrischaaldeksel naar de steriele papaïnebuis. Broed het weefsel 25 minuten in op 37 graden Celsius.
Breng na papaïne incubatie de steriele papaïnebuis en steriele BSA-buizen over naar de stroomkast. Gebruik vervolgens een 1 milliliter Pasteur pipet om alleen het corticohippocampale weefsel van de papaïnebuis over te brengen in de BSA-buis. Om grote klonten weefsel te breken, trituraat het weefsel meerdere malen met behulp van een een milliliter Pasteur pipet.
Hierna trituraat het weefsel zeven keer met behulp van een fijne tip Pasteur pipet. Breng na 30 seconden een milliliter van de onderste oplossing en weefsel van BSA-buis één naar BSA-buis twee. Triturate het weefsel in BSA buis twee keer met behulp van een fijne tip Pasteur pipet.
Breng na trituratie één milliliter van het onderste weefsel en de oplossing van BSA-buis één naar BSA-buis drie. Triturate het weefsel in BSA buis drie keer. Breng na trituratie alle oplossing en weefsel van buizen twee en drie over in BSA-buis één.
Trituraat nog twee tot drie keer en centrifuge op 3.000 keer g gedurende drie minuten. Na centrifugatie, verwijder voorzichtig het supernatant uit het gepelde weefsel en resuspend de cellen met behulp van een P1000 pipet in twee milliliters van volledige winterslaap Een lage fluorescentie medium. Triturate het weefsel vervolgens 20 keer om volledige resuspensie van de weefseloplossing te garanderen.
Vervolgens filer de cel suspensie door middel van een 30 micrometer cel zeef in een polystyreen monster buis. Bereid celsorteerbuizen voor door 300 microliters van volledige winterslaap een media voor te bereiden op het vereiste aantal polypropyleenbuizen. Kies voor elk fluorescerend celtype de juiste excitatie- en emissiefilters.
Prikkel Venus-eiwit met behulp van 488 nanometer excitatiegolflengte en detecteer het uitgezonden licht door middel van 530/40 emissiefilterset. Prikkel TdTomato-eiwit met behulp van 531 nanometer excitatiegolflengte en detecteer het uitgestraalde licht via 575/30 emissiefilterset. Sorteer voor een hoge zuiverheid helder gelabelde fluorescerende cellen.
Na celsorde, breng de verzamelde cellen over naar twee milliliter ronde centrifugebuizen. Dan centrifugeren de cellen op 3,000 keer g gedurende drie minuten om een cel pellet te vormen. Resuspend de cel pellet in de vereiste hoeveelheid voorverwarmde complete NBA medium om een celdichtheid van 1,000 cellen per microliter te bereiken.
Om de aanwezigheid van gescheiden cellen te bevestigen, controleert u de celoplossing onder een microscoop met behulp van een 4X- of een objectieve 10X-lens. Voordat de cellen worden platgetrapt, moet de vortex twee tot drie seconden op een gemiddelde snelheid zorgen om een gelijkmatige celsuspensie te garanderen. Na vortexen, snel pipette 10 microliters van de cel suspensie naar het midden van elke coverslip.
Na een uur, voeden de cellen met 500 microliters van voorverwarmde complete NBA medium en terug te keren naar de incubator op 37 graden Celsius. Om de gezuiverde neuronen en gliacellen te co-kweken, geven gliacellen door naar het vereiste aantal celkweekinsert. Dit wordt gedaan door plating 40,000 gliacellen in een 500 microliter druppel van complete NBA medium.
Na een uur, overdracht gliacel cultuur inserts naar gezuiverde neuronen. Verwijder overtollige media uit de kweekinserts en breng de platen terug naar de couveuse voor het kweken. Na succesvolle sortering moeten vergulde neuronen rond in vorm verschijnen met een glad membraan en moeten worden gezien om neuroïden na ongeveer een uur in vitro op te ruimen.
Door zeven dagen in vitro, hoewel sommige celdood duidelijk kan zijn, zouden de levensvatbare cellen in alle cultuurvoorwaarden aanwezig moeten zijn. Analyse van gezuiverde culturen blijkt dat zowel glutamatergic en GABAergic neuronen in staat waren om axonen en dendrieten uit hun cellichamen uit te breiden en de mogelijkheid te behouden om actie potentials te genereren in reactie op superdrempel depolariserende huidige injecties. Met name na zuivering, alleen GABAergic neuronen ontvangen aanzienlijke hoeveelheid spontane synaptische transmissie en glutamatergic neuronen ontvangen zeer weinig synaptische transmissie in de afwezigheid van gliacellen.
Belangrijk is dat het kweken van gezuiverde neuronen met gliacellen de groei en overleving van neuronen verbetert en synaptische overdracht in glutamatge culturen bevordert. Voldoende polariserende coating van de coverslips en het behoud van de fysiologische pH van de cultuurmedia gedurende de hele procedure zijn de sleutel tot het waarborgen van een goede kwaliteit celculturen. Volgens dit protocol moet het mogelijk zijn om RNA-sequencing en eiwitmassaspectroscopie uit te voeren op gezuiverde culturen, waardoor translationele en transcriptieprocessen kunnen worden onderzocht in specifieke neuronale typen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.