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이 프로토콜은 출생 후 생쥐 또는 쥐의 신 피 질 및 해 마 로부터 형광 GABAergic 또는 glutamatergic 뉴런의 정제 및 배양을 위한 세포 선별 방법을 설명 한다.
이 프로토콜은 특정 유형의 기본 뉴런을 정화하고 배양하기 위한 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이러한 배양은 전기 생리학, 형태학적 및 생존 분석에 적합합니다. 정제 된 뉴런의 배양은 뉴런 생리학의 기초를 연구하는 데 사용할 수 있습니다, 시냅스의 형성뿐만 아니라 뉴런 네트워크가 개발하는 방법.
우리는 피질 글루타머틱 주요 세포와 GABAergic 인터뉴런에 집중하는 동안, 이 절차는 형광 단백질을 표현하는 어떤 신경 라인을 공부하기 위하여 쉽게 수정될 수 있습니다. 유리 커버립을 준비하려면 먼저 밀리리터 PLL 용액당 200 마이크로그램의 5밀리리터 알리쿼트(aliquot)를 해동하십시오. 순수 사출 등급 물의 45 밀리리터를 추가하여 밀리리터 당 20 마이크로그램으로 이 스톡 솔루션을 희석하십시오.
그런 다음 새로운 50 밀리리터 원판 튜브로 용액을 살균하고 이 튜브를 PLL 멸균으로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 멸균 PLL 용액에 멸균 원형 12mm 유리 커버립100개. 튜브를 5분에서 10분마다 2~3분 간 교반하여 코팅을 보장합니다.
PLL 코팅 40분 후, 티슈 페이퍼 2개를 가지고 유동 캐비닛에 평평하게 놓습니다. 70%에탄올을 사용하여 종이를 살균한 다음 평평하게 하여 주름을 제거하고 건조시둡니다. PLL로 1시간 동안 유리 커버립을 코팅한 후, 과도한 PLL 용액을 제거하고 멸균 주입 등급의 물을 추가합니다.
커버립을 2~3초 동안 부드럽게 교반하여 과도한 PLL을 제거합니다. 이 헹기 단계를 두 번 더 반복합니다. 여분의 물을 제거한 다음 커버립을 멸균 조직 용지로 옮기습니다.
일단 건조하면 커버립을 24 개의 잘 배양 접시로 옮기십시오. 세포 배양 솔루션을 준비하려면 15 밀리리터 원모튜브에 세포 배양 버퍼 12 밀리리터를 측정하고 BSA로 라벨을 부착합니다. 다른 15 밀리리터 튜브에 세포 배양 버퍼의 5 밀리리터를 측정하고 papain로 라벨.
그 후, 섭씨 37도에서 두 튜브를 15분 동안 배양합니다. BSA라벨이 표시된 튜브에 120밀리그램의 BSA를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 반전시켜 용액을 용해합니다.
그런 다음 7 밀리그램의 파아를 튜브에 추가합니다. 두 튜브를 수조에 15분 간 반납합니다. 필터는 BSA 용액을 신선한 원식 튜브로 살균합니다.
멸균 BSA 용액을 3개의 튜브로 나누고 각 튜브를 BSA 멸균으로, 하나, 2 개 또는 3개의 튜브로 라벨을 부착합니다. 이제 필터는 파팡 튜브를 살균하고 튜브를 파팡 멸균으로 라벨을 붙입니다. 모든 튜브를 수조로 되돌리고 사용전까지 섭씨 37도에서 계속 배양하십시오.
조직 해부를 준비하기 위해 해마와 피질의 해부에 필요한 메스, 가위, 집게 및 주걱을 배치하십시오. 35mm 페트리 접시 2개와 무균 필터 종이가 들어 있는 100mm 페트리 접시를 유동 캐비닛에 놓습니다. 형질 전환 NexCre를 수집; Ai9 또는 vesicular GABA 수송금 금성 마우스 새끼는 야생 형 리터 메이트에서 형광 새끼를 차별하기 위해 적절한 여기 및 방출 필터와 형광 램프를 사용하여 해부되어야한다.
동물을 해부하기 직전에 각 페트리 접시에 차가운 멸균 세포 배양 버퍼를 채웁니다. 해부 후, 조심스럽게 살균 필터 종이에 형질 전환 강아지의 뇌를 전송합니다. 첫째, 소뇌를 해부하고 두 반구를 분리한다.
그런 다음 각 반구에서 해마와 피질을 조심스럽게 분리합니다. 해부된 조직을 차가운 세포 배양 버퍼를 함유한 35mm 페트리 접시로 옮춥니다. 그런 다음 해부된 해마와 피질을 다른 35mm 페트리 접시의 뚜껑으로 옮킨다.
메스 블레이드의 평평한 가장자리를 사용하여 작은 조각만 남을 때까지 십자적움직임을 조심스럽게 잘라냅니다. 다음으로, 페트리 접시 뚜껑에서 멸균 파팡 튜브로 소량의 파파인 용액으로 다진 조직을 전달한다. 25 분 동안 섭씨 37도에서 조직을 배양하십시오.
파파인 인큐베이션 후 멸균 파팡 튜브와 멸균 BSA 튜브를 유동 캐비닛으로 옮기다. 그런 다음 1 밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 파판 튜브에서 코르티코하피마 조직만 BSA 튜브 로 전송합니다. 조직의 큰 덩어리를 분해하기 위해, 1 밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 여러 번 세리세게.
이에 따라, 미세 팁 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 일곱 번 세리라. 30초 후, BSA 튜브에서 BSA 튜브 2로 하부 용액 및 조직의 1밀리리터를 전송합니다. 미세 팁 파스퇴 파이펫을 사용하여 BSA 튜브에서 조직을 두 번 트리투레이합니다.
트리튜션 후, BSA 튜브에서 BSA 튜브 3로 하부 조직 및 용액의 1밀리리터를 이송한다. BSA 튜브에서 조직을 세 번 세번 삼중시한다. 트리튜션 후, 튜브 2개와 3개의 모든 용액과 조직을 BSA 튜브 1개로 옮기.
2~3회 더 세리라기, 원심분리기는 3회, 000배에서 3분간 세정합니다. 원심 분리에 따라 펠릿 조직에서 상체를 조심스럽게 제거하고 완전한 최대 절전 모드 A 낮은 형광 매체의 2 밀리리터에서 P1000 파이펫을 사용하여 세포를 재중단합니다. 그런 다음 조직을 20번 세리라세이션하여 조직 용액의 완전한 재발을 보장합니다.
그 후, 30 마이크로미터 세포를 통해 세포 현탁액을 폴리스티렌 샘플 튜브로 체질하였다. 완전한 최대 절전 모드 A 매체의 300 마이크로리터를 필요한 수의 폴리프로필렌 튜브로 파이프팅하여 셀 선별 수집 튜브를 준비합니다. 정렬할 각 형광 세포 유형에 대해 적절한 흥분 및 방출 필터를 선택합니다.
488 나노미터 의 파장을 사용하여 금성 단백질을 흥분시키고 530/40 배출 필터 세트를 통해 방출된 빛을 감지합니다. 531 나노미터 의 포원 파장을 사용하여 TdTomato 단백질을 흥분시키고 575/30 배출 필터 세트를 통해 방출된 빛을 감지합니다. 고순도를 위해 밝게 표지된 형광 세포를 정렬합니다.
세포 선별 후 수집된 세포를 2밀리리터 라운드 하단 원심분리기 튜브로 이송합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 형성하기 위해 3, 000 배 g에서 세포를 원심 분리합니다. 마이크로리터당 1, 000 세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 미리 따뜻워진 완전한 NBA 배지의 필수 양으로 세포 펠릿을 다시 중단한다.
해리 된 세포의 존재를 확인하려면 4X 또는 10X 목표 렌즈를 사용하여 현미경으로 세포 용액을 확인하십시오. 세포를 도금하기 전에, 균등한 세포 현탁액을 보장하기 위해 2 ~ 3 초 동안 중간 속도로 소용돌이. 소용돌이 에 이어, 각 커버 슬립의 중심에 셀 서스펜션의 10 마이크로 리터를 신속하게 피펫.
1 시간 후, 전동 된 완전한 NBA 배지의 500 마이크로 리터로 세포를 공급하고 섭씨 37도에서 인큐베이터로 돌아갑니다. 정제된 뉴런과 신경교 세포를 공동 배양하기 위해, 신경교 세포를 필요한 수의 세포 배양 삽입으로 통과한다. 이것은 완전한 NBA 매체의 500 마이크로 리터 액적에서 40, 000 신경교 세포를 도금하여 수행됩니다.
1 시간 후에, 정제된 뉴런에 신경교 세포 배양 삽입을 전송합니다. 배양 인서츠에서 과도한 매체를 제거하고 배양하기 위해 플레이트를 인큐베이터로 반환합니다. 성공적인 정렬 후, 도금 된 뉴런은 부드러운 막모양으로 둥글게 나타나야하며 체외에서 약 1 시간 후에 신경증을 절약하는 것을 보아야합니다.
시험관에서 7 일까지, 몇몇 세포 죽음은 명백할 지도 모르지만, 실행 가능한 세포는 모든 배양 조건에서 존재해야 합니다. 정제 된 문화의 분석은 글루타미터기와 GABAergic 뉴런 모두 세포 체에서 축축악과 원더라이트를 확장하고 현재 주사를 탈편화 슈퍼 임계 값에 대한 응답으로 행동 잠재력을 생성하는 능력을 유지할 수 있었다는 것을 보여줍니다. 특히 정화 다음, 만 GABAergic 뉴런 자발적인 시 냅 스 전송 및 글루타마테릭 뉴런의 상당한 금액을 받은 신경 교 세포의 부재에서 아주 작은 시 냅 스 전송을 받았다.
중요 한 것은, 신경 교 세포와 정제 된 뉴런을 배양 신경 성장 및 생존뿐만 아니라 글루타머기 배양시 시 냅 스 전송을 촉진. 커버의 충분한 편광 코팅및 절차 전반에 걸쳐 배양 매체의 생리적 pH를 유지하는 것은 양질의 세포 배양을 보장하는 열쇠이다. 이 프로토콜에 따라, 특정 뉴런 유형에서 분석될 번역 및 전사 과정을 허용하는 정제 된 배양에 RNA 염기서열 분석 및 단백질 질량 분광법을 수행 할 수 있어야합니다.
