Journal
/
/
Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas
JoVE Journal
Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Genetics
Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

20,833 Views

07:56 min

April 11, 2019

DOI:

07:56 min
April 11, 2019

66 Views
, , ,

Transcript

Automatically generated

Det här protokollet använder CRISPR-Cas9 för att skapa knock-out- eller knock-in-linjer. Den största fördelen med denna teknik är att det är enkelt och effektivt att följa särskilt för nybörjare forskare. För cellpassning, behandla över natten odlade celler med två milliliter på 0,25%trypsin EDTA per platta vid 37 grader Celsius i två minuter.

När cellerna har lyft från plattan bottnar, neutralisera den enzymatiska reaktionen med två milliliter av cellodling medium, och överföra cellen suspensionen till ett koniskt rör. Samla in cellerna genom centrifugering och resuspend pelleten i fem milliliter av färskt cellodlingsmedium för räkning. Sedan utsäde 1,8 gånger 10 till de femte cellerna i en brunn av en 24-brunn vävnad kultur tallrik för natten kultur på 37 grader Celsius och 5% koldioxid.

För transfektion av cellerna, tillsätt en lämplig volym transfection mix som innehåller lämplig koncentration av CRISPR plasmid till lämplig volym transfection-reagens, enligt den experimentella konstruktionen och tillverkarens anvisningar. Efter inkuberingen av transfektionsblandningen i rumstemperatur under den rekommenderade tidsperioden, tillsätt lösningen till cellerna på ett droppvist sätt. Sedan snurra försiktigt plattan för att blanda och placera plattan i en befuktad 37 grader Celsius inkubator med 5%koldioxid.

I slutet av transfection, tillsätt 150 mikroliter av trypsin-EDTA att dissociate cellerna som bara visat och samla de fristående cellerna genom centrifugeringen. Resuspend pelleten i 2%fetala nötkreatur serum i PBS och filtrera cellerna genom en 30 mikrometer maska sil i en fem milliliter fluorescens-aktiverad cell sortering, eller FACS rör. Använd sedan de icke-transfekterade cellerna för att ställa in en negativ kontrollgrind på flödescytometern och sortera de transfekterade cellerna enligt fluorescerande markören på CRISPR-plasmiden som används för transfektionen till ett rör som innehåller 100 mikroliter av cellodlingsmedium.

När alla transfekterade celler har samlats in, pellet cellerna genom centrifugeringen vid maximal hastighet och resuspend pelleten i 300 mikroliter av cellodling medium. Frö 200 mikroliter av celler i en brunn av en 24-brunn vävnad kultur tallrik och låta cellerna att återhämta sig för ett par dagar i en 37 grader Celsius inkubator. Pellet de återstående 100 mikroliter av sorterade celler vid maximal hastighet i fem minuter och extrahera arvsmassans DNA från den resulterande pelleten enligt vanliga DNA-extraktionsprotokoll.

Därefter lägger du till 10 mikroliter av polymeraskedjereaktionsbuffert, en mikroliter av deoxynucleotide mix, 2,5 mikroliter av användardefinierade omvänd primer, 0,5 mikroliter av DNA-polymeras, två till fem mikroliter av den extraherade genomiska DNA-mallen och tillräckligt med dubbeldestillerat vatten för att få reaktionen på en slutlig volym på 50 mikroliter. Kör blandningen på en termisk cycler och lös reaktionen på en 2%agarosgel med hjälp av 1X TAE buffert enligt standardprotokoll. Använd en ren, skarp skalpell för att punktskatter polymeras kedjan reagera produkt och rena DNA med hjälp av en gel extraktion kit enligt tillverkarens instruktioner.

Mät produktens koncentration med hjälp av en spektrofotometer vid 260 nanometerabsorbans. Förbered en analys mix som innehåller 200 nanogram av den isolerade DNA, två mikroliter av T7 endonuclease I reaktion buffert, och tillräckligt dubbeldestillerat vatten för att få den slutliga volymen av blandningen till 19 mikroliter. Reanneal polymeras kedjereaktion produkt i en termisk cycler vid de angivna parametrarna och blanda fem enheter av T7 endonuclease I med reannealed produkten för en 50 minuters inkubation vid 37 grader Celsius.

Vid slutet av inkubationen, lös det smälta DNA på en 2,5%agarosgel med hjälp av 1X TAE buffert, och bild gelen på en lämplig gel avbildningssystem. Öppna gelbilden i ImageJ och rita en rektangulär ruta runt bandet så nära dess gräns som möjligt. Klicka på Analysera och Ange mått, vilket bekräftar att området, medelvärdet av grått värde och alternativen för integrerad densitet kontrolleras.

Klicka på OK och välj Analysera och Mät. Medelvärdet, eller råintensitetstäthetsvärdet, är ett tecken på bandintensiteten. När de kulturtransfekterade cellerna börjar bli konfluenta, lossa dem med trypsin-EDTA, som visats, och utsäde cellerna glest i en 100 millimeter vävnad kultur skålen för att ge tillräckligt utrymme för enskilda kolonier att växa innan de återvänder cellerna till cellkulturen inkubatorn.

När kolonierna börjar bildas, använd ett mikroskop med en fyra X förstoring för att plocka de enskilda kolonierna för överföring till enskilda brunnar av en 24-brunnsplatta som innehåller 500 mikroliter av cellodlingsmedium per brunn. Var försiktig så att ditt tips inte vidrör de omgivande kolonierna för att förhindra blandning av kolonier inom enskilda brunnar eller plocka från ett område med gles kolonitillväxt. När alla kloner har plockats, placera plattan i cellkulturen inkubatorn tills kulturerna blir konfluenta.

Som osmält plasmider är super-coiled, tenderar de att köra snabbare än sina linjäriserade motsvarigheter. För att avgöra om oligonukleotider har framgångsrikt klonats in i CRISPR plasmid ryggraden, koloni PCR utförs och de positiva klonerna inokuleras innan plasmiderna extraheras och skickas för Sanger sekvensering. Den fluorescerande signalen kan lätt visualiseras under ett mikroskop vid en lyckad leverans av plasmiderna, vilket gör att de transfekterade cellerna kan sorteras efter flödescytometri.

En T7 endonuclease I-analys utförs för att kontrollera klyvningseffektiviteten hos det genomiska DNA, enligt beräknat från intensiteterna hos de band som observerats på en agarosgel. Dessutom, om en homology-riktade reparation-baserade experiment är utformad för att införliva en begränsning webbplats vid målet locus, en begränsning fragment längd polymorfism analys kan utföras med en motsvarande begränsning enzym. För att ytterligare validera att en proteinkodande gen framgångsrikt har inaktiverats kan en western blot utföras för att säkerställa att inget riktat protein finns.

Sortering av cellerna efter transfektion eliminerar cellerna utan införlivade plasmider, vilket ökar andelen celler som screenas i senare skeden som har en knock-out eller knock-in gen. Med utvecklingen av denna teknik kan vi nu producera knock-out cellinjer för att studera genfunktion och knock-in cellinjer för att modellera specifika sjukdomar för att förstå deras mekanism.

Summary

Automatically generated

CRISPR-Cas är en kraftfull teknik för att konstruera komplexa genomen hos växter och djur. Här, detalj vi ett protokoll för att effektivt redigera det mänskliga genomet som använder olika Cas endonucleases. Vi belysa viktiga överväganden och konstruktionsparametrar att optimera redigering effektivitet.

Read Article