En dyb-sekventering-assisteret, spontane Suppressor skærm i Fission gær Schizosaccharomyces pombe

Denne protokol beskriver en enkel og effektiv suppressor skærm til at identificere suppressor mutationer i mutanter, der har en vækstdefekt i fissionsgær. Traditionelle mutagenese metoder bruger giftige kemikalier eller UV, der kan generere flere mutationer i en celle. Omvendt kan denne protokol berige en enkelt suppressor mutant i individuelle celler uden brug af mutationsfremkaldende metoder.

Begynd denne procedure med belastningskonstruktion og forberedelse som beskrevet i tekstprotokollen. Tilføj 200 mikroliter flydende medier til hver brønd af en 96-brønd polystyren mikroplade. Med en steril applikator, tage en lille mængde af hver af de forberedte kolonier og suspendere hver koloni i individuelle brønde, der indeholder de flydende medier.

Medtag en blank brønd for hver række på pladen, der indeholder 200 mikroliter af samme medie. Nu oprette protokollen på pladelæser detektion software tilsluttet en automatiseret mikroplade læser. Indstil temperaturen ved 30 grader Celsius og sæt et kinetisk program i 24 timer med læsefrekvens på to minutter.

Dette resulterer i 721 i alt læser over en 24-timers periode per brønd. Indstil rystelser til kontinuerlig hurtig orbital rysten. Indstil den optiske aflæsninger til at måle lys scatter på en bølgelængde på 600 nanometer til at måle optisk tæthed og indstille lyset til at læse fra under pladen.

Efter 24 timer registreres de endelige tomme optiske tæthedsaflæsninger, og formlen i tekstprotokollen anvendes til at bestemme det volumen, der er nødvendigt for at fortynde hver af prøverne ned til en optisk tæthed på 0,1. Hvis du vil batch behandle den fortyndingsvolumen, der skal bruges fra hver forsøgsbjændning, skal du eksportere dataene fra pladelæsersoftwaren og bruge en regnearkssoftware til at indsætte den samme formel som en funktion. Hver 24 timer, skal du bruge de samme medier som dag nul til at fortynde hver af prøverne til en optisk tæthed på 0,1 ved hjælp af formlen.

Sørg for at bruge formlen til at fortynde alle brønde ned til en optisk tæthed på 0,1. Dette omfatter brønde, der kan have begyndt at vise nogle opsving i deres vækst defekt. Gem alle vækstkurver, der genereres dagligt.

Bemærk enhver enkelt koloni, der viser en øget vækstrate bedømt af en endelig optisk tæthed, der er betydeligt højere end resten af kohorten med samme genetiske baggrund eller af en vækstkurve, der svarer til den vilde type kolonier. Denne analyse tager normalt omkring syv til 14 dage. Udfør alle trin under sterile forhold.

Fra den sidste dag i pladelæseren assay, nogle flydende kulturer har en mærkbart genvundet vækstrate formentlig ved at få en suppressor mutation, der kan lindre fænotype af forældrenes mutation. For at opbevare de fænolyserede kulturer skal 250 mikroliter flydende kultur overføres og blandes til en kryotube indeholdende 250 mikroliter på 50% glycerol. Flash fryse cellerne i flydende nitrogen og gemme stammerne i minus 80 grader Celsius på ubestemt tid.

For at bekræfte, at suppressormutationen er et genetisk arveligt element, skal du bruge standardtiske krydsningsmetoder til at krydse dine foretrukne mutant P-celler med dine foretrukne mutant S-celler. Når to haploide celler med en gratis parringstype blandes og udsættes for nitrogensult, kan de generere en zygot, der sporulater danner en tetrad af fire sporer. Forældrenes genetiske materialer vil adskille under meiose efter reglerne i Mendelian genetik.

Efter sporulation, individuelle sporer fra de samme tetrads kan dissekeres og danne fire individuelle kolonier som observeret lodret på en plade. Placersporerne jævnt en efter en på pladen ved hjælp af en mikronål. Efter dissektion, lad cellerne til at vokse i en 30 grader Celsius inkubator i et par dage, indtil kolonier vises.

Hvis suppressor mutation er et genetisk arveligt element, bør dette kors giver tetrads, hvor to kolonier har sygdom fænotype af forældrenes stamme og to kolonier har inddrivelse vækstrate af suppressor stamme. Vælg tre kolonier med suppressor fænotype og tre kolonier med forældrenes fænotype fra samme genetiske kors og fortsætte med den genomiske DNA ekstraktion og sekventering trin som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter udføre bioinformatik analyse for identifikation af suppressor mutationer som beskrevet i teksten.

Vækstkurver af de enkelte kolonier blev registreret på det oprindelige tidspunkt og i seks dage med kontinuerlig overvågning ved hjælp af pladelæseren. Som forventet viser vilde kolonier ingen mærkbare ændringer i deres vækstkurver gennem hele eksperimentet. Især fire kolonier med alf1 sletning baggrund og en fal1 sletning koloni viser en dramatisk skift i vækst fra langsomt voksende til nogle varierende niveauer af vækst svarende til vilde type kolonier.

Dramatisk, alle clr6 mutanter viser en konsekvent fænotopypisk opsving vokser i et hurtigere tempo ved udgangen af analysen. To af de identificerede ikke-synonyme ændringer, cue2-mutationen og rpl2702-mutationen blev rekonstrueret i laboratoriet ved hjælp af standardprotokoller for lokalitets styret mutagenese. Cue2 elf1 dobbelt mutanter og rpl2702 elf1 dobbelt mutanter blev krydset med den gratis alf1 sletning mutant stamme.

Genetisk krydsning viste, at de identificerede suppressor mutationer har succes med at undertrykke den langsomt voksende fænotype af elf1 sletning mutant og er arvelige. Under den daglige fortynding af 96-brøndpladen er det vigtigt at fortynde alle brønde til den samme koncentration for at undgå kunstig vækstgenvinding. Denne metode gør det muligt at isolere suppressor mutationer i en høj gennemløb måde fremskynde opdagelsen af hundredvis af gener, der ikke har været godt karakteriseret i fissionsgær og andre mikroorganismer.

Denne metode kan bruges til at isolere suppressorer for alle mikroorganismer, der har mutation forårsager vækst defekt, og som kan dyrkes til en stor befolkning i flydende kultur. Identifikation suppressor mutationer i fissionsgær kan have potentielle konsekvenser i at finde sygdomsfremkaldende gener i overlappende veje, især når det kommer til stærkt bevarede veje fra gær til mennesker.