In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression

Betydningen af vores metode er dens alsidighed og styrke. Det giver forskerne mulighed for at have robust kontrol over endogene genekspression på måder, der har været udfordrende at opnå ved hjælp af eksisterende metoder. Det giver forskerne mulighed for at undersøge et gens funktion på forskellige ekspressionsniveauer og på en spatio-tidsmæssig måde.

Således giver det mulighed for at teste reversibilitet af en fænotype, som er nyttig, når man studerer sygdomsrelaterede gener. For at opnå undertrykkelse, er målet genet intron manipuleret til at indeholde repron R, som indeholder 12 symmetriske Lac operatører. Når LacIGY-repressoren udtrykkes fra den ønskede vævsspecifikke promotor, undertrykkes målgenet.

Undertrykkelse af målgenet kan vendes eller justeres til det ønskede udtryksniveau ved administration af IPTG, en antagonist af LacIGY-undertrykkeren. For at opnå opregulering er målgenspromotoren udviklet til at indeholde fire eller flere Tat-operatører, T, som bindende steder for rtTA-M2-aktivatorerne. Når aktivatoren udtrykkes fra den ønskede vævsspecifikke promotor ved tilstedeværelse af doxycyclin, opstår der opregulering af målgenet.

Opregulering af målgenet kan vendes eller justeres til det ønskede udtryksniveau ved at trække eller ændre koncentrationen af doxycyclin. For at opnå både undertrykkelse og aktivering kan Lac-repressor- og Tat-aktivatorsystemerne kombineres. For at ændre det gene, der er af interesse for undertrykkelse, bør der identificeres en transskriptionelt intron mod den fem primære ende af det pågældende gen med henblik på indsættelse af repronsekvensen.

For at opnå den genomiske sekvens for genet af interesse, navigere til UCSC genom browser og vælge den seneste udkast til musen genom under genom fanen. Indtast navnet eller symbolet på det gen af interesse i søgefeltet for at se udskrifter for genet og klik derefter på gå. Vælg derefter den ønskede transskriptionsvariant for det pågældende gen, og klik på gensymbolet ved siden af udskriftsvarianten af interesse.

Dernæst skal du klikke på det genomiske sekvenslink under sekvensen og links til værktøjer og databaser. For indstillinger for sekvenshentningsområde skal du kun vælge exoner, introer og standardposten FASTA pr. gen. For sekvensering formatering indstillinger, skal du vælge exons med store bogstaver, alt andet med små bogstaver og maske gentages til N.Then klik send.

Gem til sidst denne sekvens, så du bevarer formateringen med store og små bogstaver i et dokument eller program, der kan kommenteres. For at undgå afbrydelse af CpG-øerne skal du vælge show for CpG-øernes spor under UCSC-genombrowserens udtryk og reguleringsbanner og klikke på Opdater. Zoome ind på de fem prime introner, skal du klikke på hver CpG ø vist med grønt, og vælg se DNA for denne funktion.

Når du har valgt maskegenteringer til N, skal du klikke på få DNA for at få CpG-øernes sekvens. Endelig overlejrer disse sekvenser med den oprindelige sekvensfil, og anmærk disse som introniske områder for at undgå. Hvis du vil undgå introniske områder med forstærkersignaturer i interessevævet, skal du navigere til encode-databasen og vælge eksperimentikonet.

For analysetypen skal du vælge ChiP-seq eller DNase-seq og udfylde de andre kategorier i henhold til de celler, der skal konstrueres. Når funktionen er markeret, skal du vælge det venstremest piktogram med blåt, for hvilket der vises vist resultater som liste. Vælg derefter datasættene for målene for h3k4 monomethylation, h3k27 acetylation, DNase 1 og CTCF, der bedst matchede de celler, der skal udvikles.

Rul til filsektionen i hvert relevant datasæt, kontroller, at mm10 og UCSC er markeret, og klik på visualiser-knappen. Nu, i UCSC genom browser, zoome ind på de fem prime introner og klik på hver top i kommenterede peak spor. Få DNA-sekvensen for hver topregion ved at klikke på kromosomkoordinaterne for hver top.

Vælg DNA i rullemenuen Vis, og klik på maskegentages til N.Endelig skal du overlejre disse sekvenser med den oprindelige sekvensfil og anmærke disse som intronic-områder for at undgå. Hvis du vil identificere et sgRNA i de resterende intronic-områder med høj specificitet og forudsagte effektivitetsresultater, skal du navigere til et online sgRNA-designværktøj efter eget valg, såsom CRISPOR. Angiv rækkefølgen af det introniske område af interesse, angiv det relevante referencegenom, og vælg det ønskede protospacer tilstødende motiv.

Klik derefter på Send. Derefter sorteres de forudsagte sgRNA’er efter specificitetsscore, og vælg en eller flere sgRNA’er, der også har en høj forudsagt effektivitetsscore. Endelig designe en DNA-skabelon, der indeholder en PITT landing pad sekvens flankeret på begge sider af 60-base homologi arme, der svarer til sgRNA cut site.

Til tilbageførsel af målgenslysning skal IPTG administreres i drikkevandet hos de homozygotavlede mus med den modificerede allel af interesse ved fuldt ud at opløse den ønskede mængde IPTG i sterilt destilleret vand på administrationsdagen. Pak flasken med folie ind og indgæng IPTG-vandet i en lysbeskyttet flaske til musene af den relevante genotype og kontroller i mindst en uge. Fortsæt med at analysere ekspressionen af genet af interesse i målvævet.

For at fremkalde genet upregulation, administrere doxycyclin i kosten i en uge og gå videre til at analysere udtryk for genet af interesse i målvævet. qRT PCR anaylisis viste, at DNMT1-udtrykket blev undertrykt til 15 % af de uregulerede niveauer ved hjælp af den initiativtagerbaserede tilgang. Undertrykkelsen blev vendt på en dosisafhængig måde ved at behandle mus med varierende mængder IPTG.

Den observerede DNMT1-undertrykkelse og tilbageførsel af DNMT1-undertrykkelse ved IPTG-behandling blev valideret på proteinniveau ved immunstaining. qRT PCR-analyse af mKate2-udtrykket viste, at den intronbaserede tilgang opnåede mere end 90 % undertrykkelse fra operatører, der var placeret flere kilobaser neden for transskriptionsstartstedet ved at dæmpe transskriptionsforlængelse. Konfokale billeder af mKate2-udtrykket i musenes lille intenstin med eller uden LacIGY-repressoren validerede den intronbaserede tilgang.

Robust opregulering og nedregulering af DNMT1-udtrykket blev opnået i embryonale stamceller, der indeholder den modificerede endogene DNMT1-allel med Tat og Lac-operatorsekvenser. Begge regler var fuldt reversible og inducerende ved IPTG og Dox behandlinger. Stærk upregulering af DNMT1 blev observeret fra leveren, milten og nyrerne.

Der blev imidlertid ikke observeret nogen påviselig opregulering i hjertet, hvilket tyder på, at det cellecyklusafhængige udtryksmønster dmnt1 og knapheden på proliferative celler i hjertet kan ligge til grund for denne observation. At studere in vivo-funktionen af et kritisk gen ved at manipulere dets udtryk har ofte været udfordrende på grund af dødelighed. Vores metode tillod os at overvinde den dødelige fænotype for vores gen af interesse og gjorde det muligt for os at studere sin rolle i tumorogenese in vivo.

På samme måde vil denne teknologi gøre det muligt at undersøge andre vigtige gener, der har været vanskelige at studere.