Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

Detta prov förberedelse teknik är utformade för att kombinera den bästa kvaliteten på ultrastruktur bevarande med den mest lämpliga kontrasten för bildframställning modalitet i en fokuserad jonstråle svepelektronmikroskop. Detta protokoll är särskilt användbart för prover som kräver beredning genom högtrycksfrysning för en tillförlitlig ultrastructure bevarande men inte får tillräckligt med kontrast under frysersättningen för volymavbildning. För minimal harts inbäddning är det viktigt att ta bort så mycket harts som möjligt för att möjliggöra korrekt inriktning senare i fokuserad jonstrålen scanning elektronmikroskop.

Till att börja med använd pipetten för att droppa en droppe på 20%PVP PBS på skärmattan. Sänk ner dissekerade nervus tibialis i droppen. Använd skalpell för att skära två millimeter längd av provet.

Använd fina tlykningar för att placera provet i en 0,2 millimeter djup typ A metall provbärare. Överför bärselen i patronens mittplatta. Placera den hexadecanebelagda lastbäraren av typ B på ovansidan som lock.

Stäng monteringen genom att sänka den övre halvan av patronen. Stäng den tredelade patronen i laststationen i högtrycksfrysen. Tryck på processknappen och fortsätt enligt tillverkarens bruksanvisning.

I ett bad av flytande kväve, placera provbärare i kryo injektionsflaska som innehåller två milliliter frysta 0,1%garvsyra och aceton och stäng locken. Placera kryo injektionsflaskan i frysersättningsenheten satt till minus 90 grader Celsius. Starta programmet och förvara proverna där i 100 timmar.

I frysersättningsenheten, tvätta proverna med två milliliter aceton tre gånger i 30 minuter. Placera 2%osmium-tetroxid i 0,1%uranylacetat i frysersättningsenheten för nedkylning och tillsätt den i proverna i sju timmars fortsatt infärgning vid minus 90 grader Celsius. När programtemperaturen i frysersättningsenheten når minus 20 grader Celsius, förvara proverna där inne i ytterligare 16 timmar.

När temperaturen stiger till 4 grader Celsius, kassera vätskan i injektionsflaskan och fyll i ren aceton. Ta bort kryo injektionsflaskan från frysersättningsenheten. Provhantering före infrysning och efter osmofication är kritiskt eftersom provet kan skadas allvarligt.

I en rökhuva, använd fina tång för att ta bort metallbärarna ur kryoflaskorna och överföra proverna från bärarna för att dränka dem i en 150 millimeter djupurglassylett fylld med aceton. Använd fina tlykningar för att överföra proverna till två milliliter reaktionsrör fyllda med aceton. Ställ mikrovågen på 250 watt i 40 sekunder och starta mikrovågsugnen för att tvätta proverna och upprepa fyra gånger.

Pipett en milliliter på 1%thiocarbohydrazide lösning i reaktionsröret och lägg den i mikrovågsugnen. Slå på vakuumfunktionen med två minuter på och två minuter av, iterering i totalt 14 minuter och ställ in den på 150 watt. Starta mikron.

Tvätta provet fyra gånger i aceton som tidigare. Pipett en milliliter av 2%osmiumtetroxidlösning in i reaktionsröret. Placera provet i mikrovågsugnen och använd samma mikrovågsinställningar som med tiocarbohydraziden.

Tvätta provet fyra gånger i aceton som tidigare. Pipett en milliliter på 25%harts i aceton i reaktionsröret och lägg den i mikron. Sätt på vakuumfunktionen i tre minuter och ställ in den på 250 watt.

Starta mikron. Använd en tandpetare för att ta bort nervus tibialis ur reaktionsröret och placera dem på en bit plastfilm. Placera en halogenlampa nära proverna för att värma upp hartsen.

Med hjälp av en tandpetare, tryck försiktigt provet runt på plastfilmen tills ingen kvarvarande harts upptäcks. Sätt plastfilmen med provet ovanpå i ugnen och ställ in temperaturen på 60 grader Celsius för att polymerisera proverna i minst 48 timmar. Använd ett rakblad för att skära ut de polymeriserade proverna tillsammans med plastfilmen i en storlek som passar SEM stub.

Använd en tandpetare för att lägga till ledande silverharts på SEM-stubbarna och fäst de skurna proverna i den. Och sedan lägga harts runt proverna. Sätt SEM stubs i ugnen för att polymerisera vid 60 grader Celsius i minst 4 timmar eller över natten.

Efter polymerisering, placera SEM stubs i en sputter coater. Ställ sputter coater på 35 milliamperes och tillämpa 10 nanometer tjock guld beläggning eller päls i en minut. Efter beläggning, placera SEM stubs inuti fokuserad jonstrålen scanning elektronmikroskop.

I denna studie, ett förstärkt protokoll utfördes för nervus tibialis av musen samt C.elegans att illustrera den optimala bevarande och kontrast för att utföra 3D-volym imaging med en fokuserad jonstråle scanning elektronmikroskop. Standardprotokoll lider ofta av en brist på membrankontrast där som det förbättrade protokollet ger en stark membrankontrast. Tvärsnittsbilderna av C.elegans med förstärkt protokoll och standardprotokoll visar en utmärkande skillnad.

Förutom tvärsnittsbilder av nervus tibialis hjälper det förbättrade protokollet till att visa en starkare membrankontrast jämfört med standardprotokoll. Efter efterbearbetningen visualiseras elektronmikroskopdata med hjälp av IMOD, ett bildbehandlings- och modelleringsprogram. Det blåmarkerade området visar segmenterade axoner.

Det rödmarkerade området visar Remak-buntarna. De gul- och orangefärgade områdena visar myelinskinn. Och det turkosa-markerade området visar mitokondrier.

Virtuell reslicing och den tredimensionella modellen illustrerar fin-vävnadsarkitekturen och hjälper till att förstå dess funktion. Andra volymskanningselektronmikroskopimetoder kan användas liksom seriell block-face scanningelektronmikroskopi och arraytomografi. Detta protokoll kan också användas för transmissionselektronmikroskopi och andra provtyper som prover från det centrala nervsystemet.

Osmiumtetroxid, tiookarbohydrozid och uranylacetat är giftiga kemikalier och bör användas noggrant. Hartset är också skadligt och bör användas med omsorg. Personlig skyddsutrustning som handskar och labbrock ska bäras för hela protokollet.