Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Cette méthode permet d’étudier le mécanisme de base de la myélinisation et de la remyélination au niveau cellulaire et tissulaire. Cette technique est à la croisée des chemins entre les cultures primaires et les approches in vivo. Il s’agit d’un modèle rapide et accessible avec le principal avantage de préserver l’architecture tissulaire.

Melina Thetiot, chercheuse postdoctorale et Rémi Ronzano, doctorant de mon laboratoire, démontreront la procédure. Pour commencer, insérez doucement un petit ciseaux dans le magnum foramen et coupez le crâne en faisant une incision latérale vers le côté, puis coupez tout autour du crâne de la tête. Pour récupérer la partie dorsale du crâne, utilisez une fine force droite pour soulever soigneusement la partie dorsale du crâne.

Introduisez ensuite soigneusement les forceps entre le crâne ventral et le cerveau. Retournez doucement le cerveau et coupez les nerfs optiques et trigeminaux avec de petits ciseaux. Ensuite, tournez la tête ou la partie dorsale du crâne à l’envers juste au-dessus d’un plat de culture cellulaire de 60 millimètres contenant un milieu de dissection glacée pour aider le cerveau à tomber par gravité.

À l’aide de forceps fins, orienter le cerveau avec le côté dorsal orienté vers le haut et le côté ventral couché. Sous le microscope binoculaire, utilisez les forceps fins et droits pour immobiliser le cerveau du côté du cerveau antérieur. Ensuite, séparez le cerveau postérieur du reste du cerveau.

Couper les péduncles cerebellar sous le cervelet pour séparer le cervelet du reste du cerveau postérieur. Une fois que le cervelet est isolé, utilisez des forceps fins et droits pour arracher soigneusement les méninges. Tenez doucement le cervelet avec les forceps fins et incurvés et placez-le avec le côté dorsal vers le haut sur la plate-forme en plastique, perpendiculairement à la lame de rasoir d’hélicoptère.

Ensuite, avec une pointe stérile et mince de pipette d’extrémité attachée à une pipette d’un millilitre, aspirez n’importe quel accès du milieu de dissection autour du cervelet. Puis, à l’aide d’un hachoir à tissus, trancher 300 sections saggitales épaisses de micromètre du cervelet. Ensuite, ajouter délicatement une goutte de milieu de dissection sur le cervelet tranché.

Puis, avec une large pointe de pipette de sanglier fixée à la pipette d’un millilitre, aspirez lentement le cervelet tranché et transférez-le de nouveau dans le plat de culture cellulaire de 60 millimètres contenant le milieu de dissection froide de glace. Ensuite, utilisez deux forceps fins et droits pour séparer les tranches individuelles. Ensuite, avec une large pointe de pipette de sanglier fixée à la pipette d’un millilitre, transférer jusqu’à quatre tranches sélectionnées du vermis, ainsi qu’un milieu de dissection sur un insert de culture d’une plaque de six puits.

Retirez tout accès de milieu de dissection autour des tranches à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité mince. Pour la démyélinisation, retirez tout milieu de culture sous les inserts de culture après six jours in vitro, et remplacez-le par un millilitre par puits du milieu de culture frais préchauffé contenant 0,5 milligramme par millilitre de LPC. Incuber pendant 15 à 17 heures à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5 %.

Après l’incubation, laver les inserts en les plaçant dans une boîte petri de 25 millilitres contenant un millilitre de milieu de culture préchauffé. Ensuite, transférez immédiatement les inserts de culture dans une nouvelle assiette de six puits, contenant un milieu de culture frais et préchauffé. Pour commencer l’immunohistochimie, utilisez d’abord des forceps pour soulever des inserts de culture et enlever le milieu de culture sous eux.

Ensuite, ajouter deux millilitres de 4%PFA en 1x PBS, ph 7.4, sur les inserts membranaires pour fixer les tranches cerebellar. Après 30 minutes, laver les tranches trois fois avec deux millilitres de 1x PBS pendant 10 minutes chaque lavage. Ensuite, sous le microscope binoculaire, à l’aide d’un grossissement de 25 x 30 x, utilisez un scalpel ou une brosse pour détacher doucement les tranches des inserts membranaires.

Ensuite, utilisez une brosse pour transférer les tranches flottantes dans les puits d’une plaque de quatre puits, contenant 1x PBS pour limiter la consommation d’anticorps. Ensuite, aspirez le PBS de chaque puits et incubez les tranches dans de l’éthanol pré-refroidi à 100 % à moins 20 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. Après l’incubation, aspirer l’éthanol à 100% et laver brièvement les tranches avec 1x PBS.

Ensuite, lavez-les deux fois à température ambiante avec 1x PBS pendant 10 minutes chaque lavage. Pour bloquer les sites de fixation d’anticorps non spécifiques, aspirez le PBS et incubez les tranches dans une solution contenant 1x PBS, 5%NGS et 0,3% détergent non ionique à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Ensuite, ajoutez des anticorps primaires dilués dans la solution de blocage et incubez les tranches à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Après l’incubation pendant la nuit, laver les tranches trois fois avec 1x PBS pendant 10 minutes chaque lavage. Ajouter ensuite les anticorps secondaires, dilués dans la solution de blocage, à un rapport de dilution de 1 à 500 et incuber les tranches à température ambiante dans l’obscurité pendant trois heures. Après incubation avec l’anticorps secondaire, laver les tranches trois fois en 1x PBS dans l’obscurité pendant 10 minutes chaque lavage.

Ensuite, sous un microscope binoculaire, placez 100 microlètes de 1x PBS sur la lame et à l’aide d’une brosse, transférez les tranches dans le PBS et aplatissez-les sur la lame. Supprimez tout accès à PBS. Enfin, placez une goutte de milieu de montage directement sur le bordereau de couverture en verre et couvrez doucement les tranches.

Des immunostainings de myéline dans les tranches organotypiques de cerebellar, obtenus des jours postnatals 9 à 10 C57 noir six souris sauvages de type ont été observés à 11 jours in vitro avec des nœuds de ronviae enrichis en canaux de sodium fermés de tension, flanqués par le domaine axoglial paranodal de jonction. Les mêmes résultats ont été observés pour les souris transgéniques PLP-GFP. La myélinisation des cellules de parkengy est principalement réalisée après une semaine dans la culture.

Le traitement de LPC démyélise complètement les tranches, qui remyelinate spontanément et sont entièrement myélinated six jours après démyélinisation. Cette procédure devrait prendre 25 minutes maximum. C’est vraiment le point le plus critique.

La culture organotypique des tranches convient à l’étude en direct de la dynamique de myélinisation. Il peut également être utilisé pour cibler des expériences de dépistage de drogues. Cette technique permet une approche facile et quantitative pour étudier les processus de myélinisation et de remylination.

Les expérimentateurs doivent suivre les procédures de sécurité de base qui s’appliquent au bien-être des animaux, à la myélinisation excessive et pointue.