إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات

هذه الطريقة تسمح لدراسة الآلية الأساسية للميل والميل على المستوى الخلوي و tissular. هذه التقنية هي في مفترق طرق بين الثقافات الأولية والنهج في الجسم الحي. وهو نموذج سريع ويمكن الوصول إليها مع الميزة الرئيسية للحفاظ على بنية الأنسجة.

ومن خلال هذا الإجراء، ستكون ميلينا تيتو، باحثة ما بعد الدكتوراه، ورامي رونزانو، طالبة دكتوراه من مختبري. للبدء ، أدخل مقصًا صغيرًا بلطف في ماغنوم الفورامين وقطع الجمجمة عن طريق إجراء شق جانبي واحد نحو الجانب ، ثم قطع جميع أنحاء الجمجمة الرأسية. لاسترداد الجزء الظهري من الجمجمة، استخدم ملقطًا مستقيمًا جيدًا لرفع الجزء الظهري من الجمجمة بعناية.

ثم أعرض بعناية ملقط بين الجمجمة البطنية والدماغ. الوجه بلطف خارج الدماغ وقطع الأعصاب البصرية وثلاثية التوائم مع مقص صغير. بعد ذلك، قم بدور الرأس أو الجزء الظهري من الجمجمة رأساً على عقب فوق طبق ثقافة الخلايا 60 ملليمتراً الذي يحتوي على وسيطة تشريح الجليد الباردة لمساعدة الدماغ على السقوط بالجاذبية.

باستخدام ملقط غرامة، وتوجيه الدماغ مع الجانب الظهري التي تواجه لأعلى والجانب البطني الاستلقاء. تحت المجهر المنظار، استخدم الملاطب الدقيقة والمستقيمة لشل حركة الدماغ على الجانب الأمامي. ثم، فصل الدماغ الخلفي عن بقية الدماغ.

قطع الرتق المخيخ تحت المخيخ لفصل المخيخ عن بقية الدماغ الخلفي. مرة واحدة يتم عزل المخيخ، واستخدام غرامة، ملقط مستقيم لتمزيق بعناية بعيدا السحايا. عقد المخيخ بلطف مع غرامة، ملقط منحني ووضعها مع الجانب الظهري حتى على منصة بلاستيكية، عموديا على شفرة الحلاقة المروحية.

بعد ذلك ، مع طرف ماص معقمة رقيقة ذات نهاية مُتعلقة بماصة ملليلتر واحدة ، يُبتدّع أي وصول إلى وسيط التشريح حول المخيخ. ثم، مع مروحية الأنسجة، شريحة 300 ميكرومتر سميكة أقسام saggital من المخيخ. بعد ذلك، أضف قطرة من توسط التشريح على المخيخ المقطع بلطف.

ثم، مع طرف ماصة خنزير واسعة تعلق على ماصة ملليلتر واحد، ببطء الpirate المخيخ شرائح ونقلها مرة أخرى إلى طبق ثقافة خلية 60 ملليمتر التي تحتوي على الجليد الباردة تشريح المتوسطة. بعد ذلك، استخدمي ملقطين مستقيمين وغرامة لفصل الشرائح الفردية. ثم، مع طرف ماصة خنزير واسعة تعلق على ماصة ملليلتر واحد، نقل ما يصل إلى أربع شرائح مختارة من فيرمي، جنبا إلى جنب مع بعض المتوسطة تشريح على إدراج ثقافة واحدة من لوحة ستة بئر.

إزالة أي وصول إلى وسيلة تشريح حول شرائح باستخدام طرف ماصة نهاية رقيقة. لإزالة الغموض، وإزالة جميع المتوسطة الثقافة تحت إدراج الثقافة بعد ستة أيام في المختبر، واستبدالها مع ملليلتر واحد في بئر من قبل تدفئة، والثقافة الطازجة المتوسطة التي تحتوي على 0.5 مليغرام لكل ملليلتر LPC. احتضان لمدة 15 إلى 17 ساعة في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪.

بعد الحضانة، وغسل إدراج عن طريق وضعها في طبق بيتري 25 ملليلتر تحتوي على ملليلتر واحد من قبل الدافئة ثقافة المتوسطة. ثم، على الفور نقل إدراج الثقافة في لوحة جديدة، ستة جيدا، تحتوي على الطازجة، قبل الدافئة المتوسطة الثقافة. لبدء الكيمياء المناعية، أولا استخدام ملقط لرفع إدراج الثقافة وإزالة الوسط الثقافة تحتها.

ثم، إضافة ملليلترين من 4٪ PFA في 1X PBS، PH 7.4، على إدراج الغشاء لإصلاح شرائح cerebellar. بعد 30 دقيقة، اغسل الشرائح ثلاث مرات بمليلترين من 1x PBS لمدة 10 دقائق لكل غسل. بعد ذلك، تحت المجهر المنظار، باستخدام التكبير 25x إلى 30x، استخدم مشرط أو فرشاة لفصل الشرائح بلطف من إدراج الغشاء.

ثم استخدم فرشاة لنقل الشرائح العائمة إلى آبار لوحة 4 جيداً، تحتوي على 1x PBS للحد من استهلاك الأجسام المضادة. ثم، الطامح برنامج تلفزيوني من كل بئر واحتضان شرائح في ما قبل تبريد 100٪ الإيثانول في ناقص 20 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد الحضانة، التعرق الإيثانول 100٪ وغسل شرائح لفترة وجيزة مع 1X برنامج تلفزيوني.

ثم، يغسل لهم مرتين في درجة حرارة الغرفة مع 1X برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق كل غسل. لمنع مواقع تثبيت الأجسام المضادة غير محددة، التعرق برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح في حل يحتوي على 1X PBS، 5٪ NGS، و 0.3٪ المنظفات غير الأيونية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب واحتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وغسل شرائح ثلاث مرات مع 1X برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق كل غسل. ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية، المخففة في محلول الحجب، بنسبة تخفيف واحد إلى 500 واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل شرائح ثلاث مرات في 1X PBS في الظلام لمدة 10 دقائق كل غسل.

بعد ذلك ، تحت مجهر منظار ، ضع 100 ميكروليترز من PBS 1x على الشريحة ومع فرشاة ، قم بنقل الشرائح إلى PBS وتسطيحها على الشريحة. إزالة أي وصول من برنامج تلفزيوني. وأخيرا، ضع قطرة من المتوسط المتصاعد مباشرة على زلة الغطاء الزجاجي وتغطية شرائح بلطف.

لوحظت مناعة Myelin في شرائح cerebellar organotypic ، التي تم الحصول عليها من أيام ما بعد الولادة 9 إلى 10 C57 أسود ستة فئران من النوع البري في 11 يومًا في المختبر مع عقد من ronviae المخصبة في قنوات الصوديوم المسورة الجهد ، محاطة بمجال تقاطع axoglial paranodal. ولوحظت نفس النتائج بالنسبة للفئران المعدلة وراثيا من PLP-GFP. ويتحقق في الغالب myelination من الخلايا parkengy بعد أسبوع واحد في الثقافة.

علاج LPC تماما demyelinates الشرائح، والتي remyelinate تلقائيا ويتم النخاع تماما ستة أيام بعد إزالة الغموض. وينبغي أن يستغرق هذا الإجراء 25 دقيقة كحد أقصى. إنها حقاً النقطة الأكثر أهمية.

تعتبر ثقافة شريحة Organotypic مناسبة لدراسة التصوير الحية لديناميات التخيل. ويمكن أيضا أن تستخدم لاستهداف تجارب فحص المخدرات. هذه التقنية تسمح سهلة، نهج كمي لدراسة عمليات الثنية وإعادة النعيم.

المجربون هي اتباع إجراءات السلامة الأساسية المطبقة على رعاية الحيوان، وفرط وحادة myelination.