髓鞘有机小脑片培养的制备及免疫染色

该方法允许在细胞和三角水平上研究肌化和再肌化的基本机制。这种技术处于初级培养物和体内方法之间的十字路口。它是一个快速和可访问的模型，主要优点是保存组织架构。

展示这个程序的将是梅丽娜·特蒂奥特，一位博士后研究员和雷米·朗扎诺，一个博士学生，来自我的实验室。首先，将一把小剪刀轻轻插入前身大体，然后向侧面切开一个侧切口，然后切开头部头骨周围的所有切口。要取回头骨的后体部分，请使用细而直的钳子小心地抬起头骨的后体部分。

然后仔细介绍腹骨和大脑之间的钳子。轻轻翻转大脑，用小剪刀切割光学神经和三叉神经。接下来，将头骨的头部或后半部分倒置，在60毫米的细胞培养盘中上方，该培养盘含有冰冷的解剖介质，以帮助大脑通过重力下降。

使用精细钳子，将大脑定向，侧朝上，腹侧朝下。在双目显微镜下，使用细而直的钳子固定大脑的前脑侧。然后，将后脑与大脑的其余部分分离。

切开小脑下小脑，将小脑与后脑的其他部分分开。一旦小脑被隔离，使用精细，直钳小心地撕掉脑膜。用细的弯曲钳子轻轻握住小脑，并用背侧向上放置到塑料平台上，垂直于切碎器剃须刀刀片。

接下来，用无菌的、薄端移液器尖端连接到一毫升移液器上，吸气，吸附小脑周围任何解剖介质。然后，用组织切碎器，切300微米厚的下垂部分小脑。接下来，轻轻在切片小脑上添加一滴解剖介质。

然后，用一个宽的猪移液器尖端连接到一毫升移液器，慢慢吸气切片小脑，并将其移回含有冰冷解剖介质的60毫米细胞培养盘。接下来，使用两个精细的直钳来分隔单个切片。然后，将一个宽的猪猪移液器尖端连接到一毫升移液器上，从 vermis 中转移多达四个选定的切片，以及一些解剖介质转移到六井板的一个培养物插入物上。

使用薄端移液器尖端去除切片周围解剖介质的任何访问。对于脱精，在体外六天后去除培养物插入物下的所有培养基，并更换为预加热的新鲜培养基，每毫升含有0.5毫克的LPC。在5%的二氧化碳环境中，在37摄氏度下孵育15至17小时。

孵育后，将刀片放入含有一毫升预热培养培养的25毫升培养皿中，清洗刀片。然后，立即将培养物转移到新的六井板中，含有新鲜的、预热的培养介质。要开始免疫性化学，首先使用钳子来提升培养物，并去除它们下面的培养基。

然后，在 1x PBS 中加入两毫升 4%PFA，ph 7.4，在膜插入物上固定小脑切片。30分钟后，用两毫升1x PBS洗涤3次，每次洗涤10分钟。接下来，在双目显微镜下，使用 25 倍至 30 倍的放大倍率，使用手术刀或刷子轻轻地将切片从膜插入件中分离出来。

然后，用刷子将浮片转移到四孔板的孔中，其中含有1x PBS，以限制抗体的消耗。然后，从每一个井中吸出PBS，在零下20摄氏度的预冷却100%乙醇中孵化切片15至20分钟。孵育后，吸100%乙醇，用1xPBS短暂清洗切片。

然后，在室温下用1x PBS清洗两次，每次洗涤10分钟。要阻断非特异性抗体固定位点，吸 PBS 并在室温下含有 1x PBS、5%NGS 和 0.3% 非离子洗涤剂的溶液中孵育切片，30 至 45 分钟。接下来，加入在阻断溶液中稀释的原抗体，并在四摄氏度下孵育切片。

过夜孵育后，用1x PBS清洗切片三次，每次洗涤10分钟。然后加入二次抗体，稀释在阻断溶液中，以1至500稀释比，在黑暗中室温下孵化切片3小时。使用二次抗体孵育后，在1x PBS中在黑暗中洗3次切片，每次洗涤10分钟。

接下来，在双目显微镜下，在幻灯片上放置 100 个 1x PBS 的微孔，用刷子将切片传输到 PBS 中，并在幻灯片上将其压平。删除 PBS 的任何访问。最后，将一滴安装介质直接放在玻璃盖滑上，轻轻盖住切片。

在产后9至10个C57黑色六种野生型小鼠体外11天中观察到的体外与在电压门控钠通道中丰富的龙威的节点，在阳生斧头结域的两侧观察到的脑炎免疫素。对PLP-GFP转基因小鼠也观察到了相同的结果。公园细胞的回血大多是在培养一周后实现的。

LPC 治疗完全脱髓化切片，其自发性解压，并在脱髓后六天完全髓化。此过程最多需要 25 分钟。这真的是最关键的一点。

有机切片培养适合对影像动力学进行现场成像研究。它也可用于靶向药物筛选实验。该技术允许一种简单、定量的方法来研究肌化和再美化过程。

实验者应遵循适用于动物福利、过度和锐利的 myeliation 的基本安全程序。