Login processing...

JoVE Journal
Biochemistry

This content is Open Access.

JoVE Journal Biochemistry

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Journal (Biochemistry)

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Journal (Biochemistry)

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Click here for the English version

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

Article DOI: 10.3791/59219-v

May 15th, 2019 •

Chase M. Clark¹, Maria S. Costa^1,2, Erin Conley¹, Emma Li¹, Laura M. Sanchez¹, Brian T. Murphy¹

¹Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago, ²Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Iceland

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

May 15th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

IDBac er en åpen-kildekode Mass massespektrometri-baserte bioinformatikk rørledning som integrerer data fra både intakt protein og spesialiserte metabolitten Spectra, samlet på celle materiale skrapet fra bakterielle kolonier. Rørledningen gjør det mulig for forskere å raskt organisere hundrevis til tusenvis av bakterielle kolonier i antatte taksonomisk grupper, og ytterligere differensiere dem basert på spesialiserte metabolitten produksjon.

Transcript

IDBac par masse spec data fra protein og spesialiserte metabolittregioner av ukjente bakterielle isolater for raskt å diskriminere mellom isolater basert på både deres identitet og deres potensielle miljøfunksjon. Vår kontorkildeprogramvare utvider nytten av eksisterende MALDI TOF-baserte mikrobielle identifikasjonsstrategier. Denne utvidelsen inkluderer analyse av spesialisert metabolisme som en ekstra måte å skille mellom kolonier med lignende fenotyper.

En stor utfordring med å karakterisere ukjente mikroorganismer er å skille mellom nært beslektede isolater. IDBac gir forskere en enkel og rask måte å karakterisere isolater gjennom protein og liten molekylprofilering. IDBac gir en visuell sammenligning av spesialisert metabolittproduksjon i en bakteriell prøve og kan gi innsikt i et bredt spekter av forskningsemner fra økologiske studier til narkotikablyfunn.

Det er mange måter at MALDI-data kan lagres mellom og blant instrumenter. Hvis du har problemer med å få filer til å fungere med IDBac, send inn et problem til IDBac's GitHub. Bruk en steril tannpirker, overfør en liten del av en bakteriell koloni til riktig sted på en ren MALDI-plate.

Spre bakteriekolonien jevnt over stedet slik at stedet ser så flatt ut som mulig. Overlegg en mikroliter på 70% massespektrometrigrad formikrosyre på prøven og matrisekontrollpunktene og la syren lufttørke i en kjemisk røykhette. Deretter legger du til en mikroliter av tidligere forberedt MALDI matriseløsning til prøve- og matrisemediekontrollpunktene og lar lufttørke helt.

Etter å ha satt opp MALDI TOF massespektrometer, skaffe spektra. Lagre proteinspektra i en mappe og den spesialiserte metabolitten spektra i en annen egen mappe. Last ned IDBac-programvaren for å starte denne prosedyren.

Dobbeltklikk på den nedlastede install_idbac for å starte installasjonsprogrammet. Deretter dobbeltklikker du på IDBac-skrivebordssnarveien for å starte IDBac som åpnes i introduksjonsfanen som standard. Klikk på Start med rådata-fanen og velg fra opprett en IDBac-eksperimentmeny hvilken type data som skal brukes med IDBac.

Når du konfigurerer konvertering og behandling av datafiler, skriver du inn et beskrivende navn for eksperimentet der du blir bedt om det, og klikker på rådatamappen og velger riktig mappe. Klikk deretter på Behandle data. Når du har konvertert filene og behandlet dem med IDBac, navigerer du til arbeidet med tidligere eksperimenter-siden og velger et eksperiment du vil arbeide med.

Legg til informasjon om eksempler ved hjelp av menyen klikk her for å endre det valgte eksperimentet. Skriv inn informasjon i det autoutfylte regnearket, og trykk lagre. Når du er klar til å starte analysen, må du sørge for at eksperimentet skal arbeide med er valgt.

Velg deretter proteindataanalyse. På siden for proteindataanalyse velger du toppinnstillingene og evaluerer proteinspektraet av prøver via de viste speilplottene. Juster prosentandelen av replikeringer der en topp må være til stede for at den skal inkluderes for analyse.

Ved hjelp av speilplottene som visuell veiledning, justerer du signalet til støyavskjæring som beholder de mest ekte toppene, og den minst støyen som ser at flere replikerer i en høyere prosentandel topp tilstedeværelsesverdi vil tillate valg av et lavere signal til støy cutoff. Etter dette angir du den nedre og øvre massen for å lade cutoffs som dikterer omfanget av masseverdier innenfor hvert spektrum som skal brukes i videre analyse av IDBac. På siden for analyse av proteindata velger du kategorien Dendrogram for å tillate gruppering av prøver i et dendrogram i henhold til brukervalgte avstandsmål og klyngealgoritmer.

Klikk velg eksempler på menyen, og følg instruksjonene for å velge eksempler som skal inkluderes i analysen. Bare prøver som inneholder proteinspektra vil bli vist i den tilgjengelige prøveboksen. Bruk standardverdiene for avstands- og klyngealgoritmene, og velg intensiteter som inndata.

Hvis du vil vise bootstrap-verdier på dendrogramet, angir du et tall mellom to og 1000 under bootstraps. Hvis du vil begynne å tilpasse dendrogrammet, åpner du menyen juster dendrogram. Hvis du vil fargelegge dendrogramlinjene, velger du klikk for å endre linjer og velger de ønskede alternativene.

Hvis du vil tegne informasjon fra regnearket ved siden av dendrogrammet, velger du knappen inkorporerer informasjon om eksempler. Dette åpner et panel der en kategori vil fylle ut selv basert på de angitte verdiene. Hvis du vil sette inn eksempler fra et annet eksperiment, velger du menyknappen sett inn eksempler fra et annet eksperiment og følger instruksjonene i det nyåpnede panelet.

Gå videre til den lille molekyldataanalysesiden for å muliggjøre datavisualisering ved prinsippkomponentanalyse og metabolske tilknytningsnettverk som bruker bipartitenettverk for å vise korrelasjonen av liten molekylmasse for å lade verdier med prøver. Klikk og dra på dendrogram for å utheve utvalgte eksempler av interesse som skal analyseres. Hvis ingen prøver er uthevet eller ingen protein dendrogram ble opprettet, en metabolitt tilknytning nettverk av enten en tilfeldig delsett eller alle prøver vil vises henholdsvis.

Hvis du vil trekke et matrisemedi tomt i metabolitten tilknytningsnettverk, åpner du menyen og velger et eksempel for å trekke fra og velger riktig eksempel som skal brukes som en tom. Åpne menyen vis/skjul MAN-innstillinger for å velge de ønskede verdiene for en prosentandel av topptilstedeværelse og replikering, signal til støy og øvre og nedre masseavskjæringer. Bruk de små molekylspeilplottene til å veilede valget av disse innstillingene.

For rapportering av resultater kopierer du teksten i avsnittet forslag til rapportering av MAN-analyse for å gi de brukerdefinerte innstillingene som brukes til å generere opprettet metabolsk tilknytningsnettverk. Seks stammer av Micromonospora chokoriensis og to flekker av Bacillus subtilis ble analysert ved hjelp av data i IDBac-programvaren. Følgende veibeskrivelser i kategorien rådata ble alternativet klikk her for å konvertere Bruker-filer valgt, og IDBac-instruksjonene ble fulgt for hvert datasett.

Til de automatiserte trinnene for konvertering og forhåndsbehandling av toppbehandling ble det opprettet et kombinert IDBac-eksperiment ved å overføre Bacillus- og Micromonospora-eksempler fra de to eksperimentene til ett enkelt eksperiment. Den resulterende analysen involverte sammenligning av proteinspektra ved hjelp av speilplott som var nyttige for å evaluere spektrakvalitet og justere toppinnstillinger. Et skjermbilde av proteinklyngeresultatene med standardinnstillingene valgt, vises her.

Dendrogram ble farget ved å justere terskelen på plottet. Merk er den klare separasjonen mellom slekter med både M.chokoriensis og B.subtilis isolerer klynger separat. Ved å klikke og dra over protein dendrogram, det var mulig å raskt opprette metabolske foreningen nettverk for å sammenligne bare B.subtilis stammer, bare M.chokoriensis stammer, og alle stammene samtidig.

Den primære funksjonen til disse nettverkene er å gi forskerne en bred oversikt over graden av spesialisert metabolitt overlapping mellom bakterier. Når du arbeider med nye data, bruk IDBac speilplott for å sikre at dataene dine gir mening og spektra er av høy kvalitet. Vurder eksperimentell design og resultater på et trinn kritisk.

IDBac gjør det mulig for forskere å bygge små og varierte biblioteker av mikroorganismer for videre undersøkelse. Dette reduserer i stor grad kostnadene forbundet med tradisjonelt store og overflødige mikrobielle biblioteker. Fordi IDBac lar deg visualisere spesialisert metabolittoverlapping i svært like fylogenetiske grupper, kan den brukes til å generere forskningsspørsmål og hypoteser som kobler to vanligvis frakoblede felt.

Maursyre er etsende og bør håndteres i en kjemisk røykhette. Noen miljøisoler kan utgjøre potensielle helsefarer, og alle stammer bør behandles som biosikkerhet nivå to.

X

Simple Hit Counter