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March 29, 2019
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我们的方法的意义是它的多功能性和效力。它允许研究人员以使用现有方法具有挑战性的方式对内源基因表达进行强有力的控制。它允许研究人员以时空方式研究基因在不同表达水平上的功能。
因此，它允许测试表型的可逆性，这对于研究疾病相关基因很有用。为了完成抑制，目标基因内创器被设计为包含 repron R，其中包含 12 个对称 Lac 运算符。当 LacIGY 抑制器从所需的组织特定启动子表示时，目标基因被抑制。
通过给给的IPTG，一个LacIGY抑制剂的拮抗剂，可以逆转或调整目标基因的抑制到所需的表达水平。为了完成上调节，目标基因启动子被设计为包含四个或更多Tat运算符，T，作为rtTA-M2激活剂的结合位点。当活化剂在多氧环素存在的情况下从所需的组织特异性启动子中表达时，诱导目标基因的上调节。
通过提取或改变多氧环素的浓度，可以反转或调整目标基因的上调节，或调整到所需的表达水平。为了实现抑制和激活，Lac 抑制器和 Tat 激活器系统可以组合在一起。为了修改抑制的兴趣基因，应识别一个转录惰性内向感兴趣的基因的五个主要端，以插入重压序列。
要获取感兴趣的基因的基因组序列，请导航到 UCSC 基因组浏览器，并在基因组选项卡下选择小鼠基因组的最新草稿。在搜索栏中输入感兴趣的基因的名称或符号，以查看该基因的转录本，然后单击”转到”。然后，为感兴趣的基因选择所需的转录体，然后单击感兴趣的转录体变体旁边的基因符号。
接下来，在工具和数据库的序列和链接下，单击基因组序列链接。对于序列检索区域选项，仅选择 exons、intron 和默认的一个 FASTA 记录每个基因。对于排序格式选项，选择大写例的 exon，小写的所有内容，并掩码重复到 N.然后，单击提交。
最后，保存此序列，在文档或程序中保留可注释的大写和小写格式。为避免 CpG 岛屿中断，请在 UCSC 基因组浏览器的表达和调节横幅下为 CpG 岛屿轨道选择”显示”，然后单击刷新。放大五个主要内子，单击以绿色显示的每个 CpG 岛，然后选择查看此功能的 DNA。
选择掩码重复到 N 后，单击 get DNA 获取 CpG 孤岛序列。最后，将这些序列与原始序列文件叠加在一起，并注释这些序列作为要避免的 intronic 区域。为了避免在感兴趣的组织中具有增强剂特征的内向区域，请导航到 ENCODE 数据库并选择实验图标。
对于检测类型，选择 ChiP-seq 或 DNase-seq，然后根据要设计的细胞填充其他类别。要素选择后，选择蓝色左侧最象形图，视图结果将显示为列表。然后，选择 h3k4 单甲基化、h3k27 乙酰化、DNase 1 和 CTCF 的目标数据集，这些数据集与要设计的细胞最匹配。
在每个相关数据集中，滚动到文件部分，验证是否选择了 mm10 和 UCSC，然后单击可视化按钮。现在，在 UCSC 基因组浏览器中，放大五个主要内子，然后单击带注释的峰值轨迹中的每一个峰值。通过单击每个峰的染色体坐标，获取每个峰区域的 DNA 序列。
在视图下拉菜单中，选择 DNA，然后单击掩码重复到 N.Finally，用原始序列文件覆盖这些序列，并注释这些序列作为 intronic 区域以避免。要识别其余非电子区域中的 sgRNA，请导航到首选的在线 sgRNA 设计工具，如 CRISPOR。输入感兴趣的内向区域序列，指定相关的参考基因组，并选择所需的原空间相邻图案。
然后，单击”提交”。接下来，按特异性分数对预测的 sgRNA 进行排序，并选择一个或多个也具有高预测效率分数的 sgRNA。最后，设计一个DNA模板，其中包含一个PITED着陆垫序列，两侧由60个基基同源臂，对应于sgRNA切割位置。
为了扭转目标基因抑制，在同源小鼠的饮用水中管理IPTG，使用感兴趣的修饰等位基因，在施用当天完全溶解无菌蒸馏水中所需的IPTG量。用铝箔包裹瓶子，将IPTG水用一个受光保护的瓶子管理给适当基因型的老鼠，并控制至少一周。继续分析目标组织中感兴趣的基因的表达。
为了诱导基因的调节，在饮食中施用多氧环素一周，然后开始分析目标组织中感兴趣的基因的表达。qRT PCR分析显示，使用基于启动子的方法，DNMT1表达被抑制到15%的不受管制水平。通过治疗不同数量的IPTG小鼠，以剂量依赖的方式扭转了抑制。
观察到的DNMT1抑制和IPTG治疗DNMT1抑制的逆转在蛋白质水平上通过免疫污染得到验证。mKate2表达的qRT PCR分析表明，通过衰减转录伸长，基于内创的方法从位于转录开始站点下游几个千基的操作员实现了90%以上的抑制。有或没有LacIGY抑制器的小鼠小强度中的mKate2表达的共和图像验证了基于内创的方法。
在含有Tat和Lac操作器序列的改性内源DNMT1等位基因的胚胎干细胞中，对DNMT1表达实现了强有力的上调节和下调节。这两种法规都是完全可逆的，可由IPTG和Dex处理。从肝脏、脾脏和肾脏观察到对DNMT1的强调节。
然而，在心脏没有检测到的上调节，这表明DMNT1的细胞周期依赖表达模式和心脏增殖细胞的缺乏可能是这一观察的根据。由于致命性，通过操纵关键基因的表达来研究其体内功能往往具有挑战性。我们的方法使我们能够克服我们感兴趣的基因的致命表型，并使我们能够研究它在体内肿瘤生成中的作用。
同样，这项技术将促成其他难以研究的基本基因的研究。
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该协议概述了生成模型系统所需的步骤, 在该模型系统中, 相关内源基因的转录可以在活体动物或细胞中使用增强的 lac 抑制和/或 tet激活剂系统有条件地控制。
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Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).
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