Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
هذا البروتوكول يحدد أسلوب رواية الدهن الحبرية العزل وتنقية من كبد الفأر، استخدام عدة عزلة هيولى راسخة.
Transcript
وقد أعاقت صعوبة تنقية البحوث في بيولوجيا قطرات الدهون. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب دراسة تدفق الدهون الخلوية تنقية متزامنة من العضيات المتعددة، ولم تكن هناك بروتوكولات بسيطة متاحة حاليًا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو جعل تنقية قطرات الدهون أكثر سهولة.
قمنا بتعديل مجموعة متاحة تجاريا لعزل قطرات الدهون في وقت واحد ، إندوبلاسميك التشنج ، وlysosomes من عينة واحدة. تراكم قطرات الدهون الكبد يهيئ السمنة والمرضى الكحولية لمرض الكبد التدريجي. وقد حوّل ذلك وجهة نظر قطرات الدهون من مقصورات التخزين الخاملة إلى العضيات الحيوية المهمة بيولوجياً.
للبدء ، استخدم ملقطًا معقمة ومقصًا لتشريح الجلد والعضلات من بطن الفأرة الرحيم على المحور الأمامي ، مما يعرض الكبد. قطع الأربطة التي تربط الكبد إلى الأمعاء. باستخدام ملقط، سحب الأمعاء بعيدا عن الكبد، نحو الخلفي.
قطع الرباط الذي يربط الكبد إلى الحجاب الحاجز. ثم، قطع بين الكبد والقفص الصدري الظهري، والانتقال من الأمامي إلى الخلفي، حتى يتم تحرير الكبد. نقل الكبد إلى طبق بيتري الباردة خمسة سنتيمترات مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة 1x، وغسل الكبد مرتين على منصة هزاز في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة 1X لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد الغسيل النهائي ، صب قبالة برنامج تلفزيوني 1x ، واستخدام شفرة جراحية معقمة الحجم 10 لنرد الكبد في ثلاثة إلى خمسة ملليمترات القطع داخل الطبق. ثم، غسل الكبد مكعبات مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد 1x لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. Decant برنامج تلفزيوني 1x، ونقل قطع الكبد مكعبات إلى 45 ملليلتر التجانس دونسي الباردة، وضمان جميع القطع هي في الجزء السفلي.
إضافة سبعة ملليلتر من الباردة 1x IE العازلة. التجانس على الجليد عن طريق تحريك الآفات صعودا وهبوطا 20 مرة، والتأكد من أن الآفة يذهب إلى الجزء السفلي من التجانس خلال كل السكتة الدماغية. نقل المتجانسة إلى أنبوب الطرد المركزي الباردة 15 ملليلتر.
شطف التجانس مع ملليلتر واحد من الباردة 1x IE العازلة، وإضافته إلى بقية التجانس. لإزالة النوى، الطرد المركزي المتجانس في جهاز طرد مركزي عالي السعة في 1،000 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تأكد من أن أي الدهون التي تم جمعها في الجزء العلوي من أنبوب 15 ملليلتر هو resuspended لمنع فقدان LD.
التأكد من أن بيليه النووية في الجزء السفلي من الأنبوب غير مضطربة، ونقل فائقة ما بعد النووية التي تحتوي على الدهون إلى أنبوب طرد مركزي بارد طازج 50 ملليلتر. نقل aliquot 100 ميكرولتر من عظمى ما بعد النووية إلى أنبوب microcentuguge الباردة 1.7 ملليلتر على الجليد لتحليل النقاء في وقت لاحق. لإزالة الميتوكوندريا، الطرد المركزي العينة فائقة ما بعد النووية في جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة في 12،000 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.
تأكد من أن أي الدهون التي تم جمعها في الجزء العلوي من الأنبوب هو resuspended لمنع فقدان LD، ومن ثم نقل سوبرنات ما بعد الميتوكوندر إلى أنبوب 13 ملليلتر فائقة التركيز. نقل 100 ميكرولتر aliquot من ما بعد الميتوكوندريا supernatant إلى أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر الباردة على الجليد لتحليل النقاء في وقت لاحق. ملء أنبوب فائقة التركيز مع ما بعد الميتوكوندريا supernatant إلى حافة مع الباردة 1x IE العازلة، لمنعها من الانهيار أثناء الطرد فوق المركزية.
توازن العينات، ومن ثم الطرد المركزي في الطرد فائقة المركزية في 100، 000 مرات ز لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية. لإزالة طبقة LD، إمالة الأنبوب بزاوية 45 درجة، وpirate مع ماصة زجاجية. بعد نقل بيليه إلى أنبوب الطرد الدقيق 1.7 ملليلتر بارد ، جمع 100 ميكرولترات من ما بعد ER عظمى تحت طبقة الدهون لتحليل النقاء.
لبيدي أي حطام الخلية، الطرد المركزي في الطرد المجهري في السرعة القصوى لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم، تسخين الأنبوب بلطف مع اليدين للمساعدة في إعادة تعليق طبقة LD، ونقل المغرور، بما في ذلك طبقة الدهون، إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر microcentrifuge. كرر هذه الخطوات الغسيل، وتسخين الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات، حتى بيليه لم يعد مرئيا.
ثم، لغسل ناظر LD الخالي من الكريات، أضف 1x PBS إلى حجم نهائي من 1.5 ملليلتر، وطاردة مركزية في ميكروسنتريفوج بسرعة قصوى لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. استخدام ماصة زجاجية لإزالة ملليلتر واحد من 1X PBS، الذي هو تحت طبقة الدهون، دون إزعاج طبقة الدهون. كرر غسل LD أربع إلى خمس مرات، حتى 1x PBS شفافة بصريا مع عدم وجود عكر.
ثم، استخدام ماصة زجاجية لإزالة كل 1X برنامج تلفزيوني تحت طبقة الدهون، واستخدام الناتجة كسور LD النقية لتحليل المصب. عندما تم أخذ ممثل 20x الفلورسنت و Brightfield LD الصور من كل من ER عدة LD العزل وأساليب العزل السكروز LD, أنها كشفت عن مستويات مماثلة من الجسيمات المواد, مما يشير إلى تنقية مماثلة باستخدام بروتوكولين مختلفين. بعد تنقية, تم قياس مستويات البروتين البروتين و LD الدهون باستخدام المقايسات colorimetric, وتم تطبيع البيانات إلى وزن الكبد, تبين أنه عندما تم تطبيع المواد الأولية, LD الدهون الثلاثية وغلة البروتين كانت مماثلة باستخدام طقم ER وطريقة السكروز.
تم تحديد أقطار LD باستخدام برنامج تحليل الصور ، مما يدل على أن مجموعة ER LD العزلة وعزلة sucrose LD أسفرت عن LDs من أحجام مماثلة. لتقييم نقاء LD ، تم فحص العينات عن طريق التنمون ، مما يدل على أن LDs المستمدة من طقم ER LD العزل وبروتوكول التدرج السكروز على حد سواء كان على قدم المساواة النقاء. تم الكشف عن PLIN2 ، وهي علامة LD ، في جميع العينات باستثناء مجموعة ER LD العزل PER و PNS من السكروز.
تحليل النقاء من ER كسر باستخدام مناعة يظهر أنها كانت خالية من LD علامة PLIN2 ولكن كان مستويات كبيرة من البروتين ER SEC61A. كما تم تقييم نقاء الكسر الليسوميوم بعد المزيد من تنقية الليسوزومات باستخدام مجموعة التخصيب الليسوسوم. الاكتشاف هو حاليا التطبيق الأكثر فائدة لبروتوكولنا.
نحن أداء الدهون في العضيات النقية، وأظهرت زيادة السموم الدهنية على وجه التحديد في قطرات الدهون في أمراض الكبد الكحولية.
Tags
علم الأحياء، العدد 146، الدهن الحبرية العزلة، الكبد، بيريليبين 2، هيولى، السكروز استخراج التدرج، ومتساوي التوتر المخزن المؤقتRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
