Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

هذا البروتوكول يحدد أسلوب رواية الدهن الحبرية العزل وتنقية من كبد الفأر، استخدام عدة عزلة هيولى راسخة.

Abstract

قطرات الدهن (LDs) هي النشطة بيولوجيا العضيات الموجودة داخل سيتوسول الأكثر حقيقية النواة وبعض الخلايا بدائية. قديسي الأيام الأخيرة تتكون من الدهون محايدة المغطى باحادي الطبقة فوسفوليبيدات والبروتينات. الكبد LD الدهون، مثل سيراميد، والبروتينات، ومتورطة في العديد من الأمراض التي تسبب ذلك الكبد. على الرغم من أن الأساليب السابقة أقيمت لعزل LD، أنها تتطلب تحضير تستغرق وقتاً طويلاً من الكواشف وليست مصممة لعزل المقصورات سوبسيلولار متعددة. سعينا إلى وضع بروتوكول جديد لتمكين عزل LDs، هيولى (ER)، وليسوسوميس من كبد واحدة بماوس.

علاوة على ذلك، جميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول المعروضة هنا متوفرة تجارياً وتتطلب إعداد كاشف الحد الأدنى دون التضحية بنقاء LD. هنا نقدم بيانات مقارنة هذا البروتوكول الجديد لبروتوكول تدرج سكروز قياسية، مما يدل على نقاء قابلة للمقارنة، ومورفولوجيا والغلة. بالإضافة إلى ذلك، ونحن عزل ER وليسوسوميس باستخدام نفس العينة، توفير تفاصيل أعمق لتشكيل والتمويه داخل الخلايا للدهون والبروتينات المرتبطة بهم.

Introduction

قديسي الأيام الأخيرة هي النشطة بيولوجيا العضيات الموجودة في سيتوسول الخلايا حقيقية النواة أكثر وبعض الخلايا بدائية1،،من23. الأساسية LD يتكون من الدهون محايدة مثل استرات الكولسترول والدهون الثلاثية (TG). كما أنها تحتوي على سيراميد، الدهون النشطة بيولوجيا المتورطين في إرسال الإشارات الخلوية مسارات4،5. دس محاطة أحادي الطبقة فسفوليبيد ومغلفة بالبروتينات، بما في ذلك بيريليبين البروتينات بيريليبين 2 (PLIN2) و 35،1،(PLIN3)6. كما حضر من الإنزيمات ليبوجينيك وليباسيس وبروتينات الغشاء الاتجار غير المشروع التي تم ربطها إلى عدة أمراض الكبد ستيتوتيك، بما في ذلك الدهنية أمراض الكبد وأمراض الكبد الكحولية والالتهاب الكبدي ج3،5 ،،من67،،من89،10.

ويعتقد قديسي الأيام الأخيرة تشكل من الغشاء الخارجي للائحة، وتتضمن المركبة حديثا تيراغرام مصدرها الأحماض الدهنية الحرة المستمدة من أية11. بيد أنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الدهون المجمعة برعم، تظل متصلاً، أو هي اقتطعت من ER6،11، مما يجعل عزل LDs خالية من أية صعوبة من الناحية التقنية. الأحماض الدهنية الحرة يمكن أن يتحرر من LDs العمل الذي قامت به ليباسيس السطحية لتوفير إنتاج الطاقة أو تركيب الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتحلل LDs عبر ليبوفاجي كآلية تنظيمية وإنتاج الأحماض الدهنية الحرة12.

هناك جانب ER و lysosomes، العضيات الأخرى – مثل الميتوكوندريا، اندوسوميس، بيروكسيسوميس، وغشاء البلازما – التي توجد ضمن الارتباط الوثيق لقديسي الأيام الأخيرة11. هذا تعدد الزوجات ضيق يجعل من الصعب القيام استخراج LD نقية. ومع ذلك، يمكن اتخاذها الفطرية ذات الكثافة السكانية المنخفضة الدهون محايدة ميزة عن طريق الطرد المركزي5.

تقليديا، وقد تم دس عزل استخدام سكروز كثافة متدرجة1،،من513. بيد أن هذه الأساليب قد لا صممت لعزل العضيات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تتطلب إعداد الكواشف تستغرق وقتاً طويلاً. يتكيف هذا البروتوكول عزلة ER متاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد) للسماح لعزل دينار. ونحن نستخدم استخراج المخزن المؤقت المقدمة من هذه المجموعة، إضافة خطوة عزلة LD. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام البروتوكول ER وعزل الليزوزومية استخدام العينات نفسها، مما يتيح الحصول على صورة أكثر شمولاً لدورة الحياة لقديسي الأيام الأخيرة. للتحقق من صحة هذا الأسلوب الجديد، ونحن الاعتداء الغلة LD ومورفولوجيا والحجم والنقاء. قارنا النتائج المعروضة هنا لتلك التي تم الحصول عليها مع بروتوكول مستخدمة على نطاق واسع باستخدام تدرج سكروز لعزل LD.

كنا 10 إلى 12 أسبوع-عمرها، الماوس C57BL/6 الإناث 20 غ صام ح 16 (إزالة المواد الغذائية في 05:00 م لمدة عزل LD 09:00 ص) مع حرية الوصول إلى المياه. العائد نموذجية تيراغرام الكبد 0.6 مغ/ز، وهو للبروتين LD، الكبد 0.25 مغ/ز. وهذا يوفر ما يكفي من المواد إيمونوبلوتس ~ 10 بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي. البروتوكول أدناه تفاصيل والكواشف المستخدمة وبروتوكول مناسب لكبد واحد ز 1. البروتوكول العزلة التدرج السكروز هو مقتبس من ساتو14 و15من وو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب على مقاعد البدلاء مختبر بمعدات الحماية الشخصية الملائمة للمستوى الأول، بما في ذلك معطف مختبر، والقفازات، ونظارات واقية والسلامة الأحيائية. وأجريت التجارب وفقا للبروتوكولات المعتمدة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بنسلفانيا. قد بذلت جميع الجهود للتقليل من عدم الراحة الحيوان، والحيوانات تعامل مع الرعاية الإنسانية.

1-LD عزلة باستخدام مجموعة مواد عزل ER

  1. إعداد
    ملاحظة: المبالغ المدرجة في القائمة مناسبة لكبد الفأر ز 1 واحد.
    1. إعداد 10 مل من 1 x المخزن المؤقت (أي المخزن المؤقت، ومن عدة عزل ER) استخراج متساوي التوتر بتمييع مل 2 x 5 IE المخزن المؤقت مع 8 مل من الماء عالي النقاوة. بارد المخزن المؤقت بوضعه على الجليد.
    2. تحضير 100 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بإذابة 10 مل من برنامج تلفزيوني x 10 في 90 مل من الماء عالي النقاوة. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    3. إعداد 10 مل من 5% البولي إثيلين غليكول ف-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)--فينيل البروم ثنائي الفينيل (بجبي) بتمييع ميليلتر 500 من بجبي في مل 9.5 من الماء عالي النقاوة. استخدم حقنه 1 مل لقياس بجبي كما لزج. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    4. كول جميع الأنابيب بوضعها على الجليد: 13 مل ultracentrifuge أنابيب وأنابيب الطرد المركزي عالية السرعة 50 مل، 1.7 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب وأنابيب الطرد المركزي 15 مل.
    5. بارد كل ما يلزم من أجهزة الطرد المركزي إلى 4 ° c: ميكروسينتريفوجي، الطرد مركزي ذات قدرة عالية لمل 15 أنابيب، الطرد مركزي عالية السرعة لأنابيب 50 مل، وأولتراسينتريفوجي.
    6. تعقيم مقص ملقط والتشريح بالتعقيم.
  2. إعداد الأنسجة
    1. Euthanize الماوس بوضعه في غرفة مليئة 100% CO2 ل 10 دقيقة القتل الرحيم تأكيد قبل تنفيذ التفكك عنق الرحم.
    2. استخدام الملقط العقيمة ومقص التشريح، قطع في طبقات الجلد والعضلات البطن على المحور الأمامي/الخلفي لفضح الكبد.
    3. قص الأربطة الاتصال الكبد بالحجاب الحاجز والأمعاء. استخدام الملقط لسحب الأمعاء بعيداً عن الكبد، واتجاه الخلفي، لفضح الأربطة.
    4. قطع بين الكبد وفي القفص الصدري الظهرية، الانتقال من عرفت الخلفي حتى تتحرر الكبد.
    5. نقل الكبد إلى 5 سم باردة طبق بيتري مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
    6. تغسل الكبد 2 x على منصة هزاز في 10 مل من برنامج تلفزيوني x 1 البارد لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في سم 5 طبق بيتري. من أجل إيقاف برنامج تلفزيوني 1 x بعد الغسيل النهائي.
    7. استخدام شفرة جراحية معقمة الحجم 10 (انظر الجدول للمواد) للنرد الكبد إلى قطع 3 – 5 مم في الطول 5 طبق بتري (الشكل 1A).
    8. تغسل الكبد مكعبات 2 x مع 10 مل من برنامج تلفزيوني x 1 البارد لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في سم 5 طبق بيتري.
      ملاحظة: لعزل يحلول، نقل 0.5 غ كبد إلى الخالطون نظيفة 45 مل واتبع الإرشادات المقدمة من استخراج يحلول كيت (انظر الجدول للمواد).
    9. صب 1 x برنامج تلفزيوني ونقل القطع مكعبات الكبد الباردة 45 مل الخالطون دونس. ضمان جميع القطع الذهاب إلى أسفل الخالطون.
    10. إضافة 7 مل من المخزن المؤقت IE x 1 الباردة (من عدة عزل ER) ومجانسة على الجليد بتحريك مدقة صعودا وهبوطاً 20 x. ضمان أن المدقة يذهب إلى أسفل الخالطون خلال كل السكتة الدماغية.
    11. نقل هوموجيناتي (الشكل 1B) إلى أنبوب الطرد مركزي باردة 15 مل.
    12. شطف الخالطون مع 1 مل من البرد 1 × المخزن المؤقت IE (من عدة عزل ER) وهذا إضافة إلى بقية هوموجيناتي.
  3. عزل LD
    1. إزالة الأنوية من سينتريفوجينج هوموجيناتي في قدرة عالية أجهزة الطرد مركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية (الشكل 1).
    2. نقل المادة طافية بوستنوكليار (السندات الإذنية) إلى أنبوب الطرد مركزي الجديد، الباردة 50 مل. لمنع فقدان LD، ضمان أن الدهن أي تجمع في الجزء العلوي من الأنبوبة 15 مل هو حراكه قبل تحويل السندات الإذنية.
    3. تتخذ من 100 ميليلتر الكوة من السندات الإذنية لتحليل النقاء ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 باردة. وضعه جانبا على الجليد.
    4. لإزالة الميتوكوندريا، الطرد المركزي عينة السندات الإذنية، لا قاسمة في الطرد مركزي عالية السرعة مبردة في س 12,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      1. اختياري: للنفط الخام يعزل LD (CLD) (مع تلوث سيتوسول وغشاء الخلية)، جمع طبقة الدهن أعلى باستخدام ماصة زجاجية وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل. يواصل قسم 1.4.
    5. نقل المادة طافية بوستميتوتشوندريال (PMS) إلى أنبوب أولتراسينتريفوجي. لمنع فقدان LD، ضمان أن الدهن أي تجمع في الجزء العلوي من حراكه قبل نقل الدورة الشهرية.
    6. تتخذ من 100 ميليلتر اليكووت من مس لتحليل النقاء ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 باردة. وضعه جانبا على الجليد.
    7. ملء أنبوب ultracentrifuge حتى أسنانها مع الباردة 1 × IE العازلة لمنع الأنبوب الانهيار خلال تنبيذ فائق.
    8. تحقيق التوازن بين العينات والطرد المركزي لهم في أولتراسينتريفوجي في س 100,000 ز لمدة 60 دقيقة عند 4 درجة مئوية (الشكل 1).
    9. لإزالة طبقة LD، إمالة الأنبوبة بزاوية 45 درجة واستخدم ماصة زجاجية لنضح. نقل بيليه إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 باردة.
      ملاحظة: يتضمن بيليه ER معزولة. استخدام كسر هذا المصب لعزل ER.
    10. جمع 100 ميليلتر من المادة طافية بوست-ER (في) تحت طبقة الدهن لتحليل النقاء.
  4. الغسيل LD
    1. إضافة 1 x برنامج تلفزيوني للكسر LD جمعت في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7، إلى وحدة تخزين إجمالي 1.3 مل.
    2. الدوامة العينة.
    3. الطرد المركزي في ميكروسينتريفوجي في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه أي حطام خلية. الحارة الأنبوب بلطف بيديه لمساعدة ريسوسبيند على طبقة دينار. نقل المادة طافية، بما في ذلك طبقة الدهن، لأنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 جديدة.
    4. كرر الخطوات 1.4.1–1.4.3 2 x x-3، حتى بيليه لم يعد مرئية.
    5. إضافة 1 x PBS LD خالية بيليه طاف بحجم 1.5 مل نهائي. المياه والصرف الصحي كسر الدهون بالطرد المركزي في ميكروسينتريفوجي في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. إزالة 1 مل من 1 x PBS (تحت طبقة الدهن) مع ماصة زجاجية دون إزعاج في طبقة الدهن.
    7. كرر الخطوات من 1.4.5 و 1.4.6 x x-5 4، حتى برنامج تلفزيوني 1 x شفاف بصريا مع لا تعكر.
    8. قم بإزالة كافة 1 x برنامج تلفزيوني تحت طبقة الدهن، استخدام ماصة زجاجية (الشكل 1E).
    9. استخدام النتيجة، كسر LD الصرفة، لتحليل المتلقين للمعلومات.
  5. دينار كوانتيتيشن البروتين بتحليل حمض بيسينتشونينيك
    ملاحظة: لا تستخدم مقايسة حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) إذا كانت مورفولوجيا LD إلى تقييم.
    1. ريسوسبيند دينار في 500 ميكروليتر من بجبي 5%.
    2. يغلي عينات لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية، دوامة لهم، واحتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتبرد.
    3. كرر الخطوة 1.5.2 x 2 إضافية.
    4. Sonicate العينات لمدة 5 دقائق مع 30 s/إيقاف دورة، بكثافة متوسطة.
    5. تطبيع العينات بقياس تركيز البروتين في جميع عينات التحليل النقاء والكسر LD بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي.

2-LD عزل استخدام السكروز الكثافة المتدرجة

  1. إعداد
    1. جعل 200 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 7.4]، 1 مم يدتا [pH 8.0]). بارد عليه بوضعه على الجليد.
    2. جعل 100 مل محلول السكروز 60% (w/v) في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات بتذويب ز 60 من السكروز في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، يصل الحجم النهائي إلى 100 مل. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    3. جعل 6 مل محلول السكروز 40% (w/v) بإضافة 4 مل من محلول السكروز 60 في المائة إلى 2 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    4. جعل 6 مل محلول السكروز 25% (w/v) عن طريق إضافة 2.5 مل من محلول السكروز 60% إلى 3.5 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    5. جعل 4 مل محلول السكروز 10% (w/v) عن طريق إضافة 0.7 مل من محلول السكروز 60 في المائة إلى 3.3 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    6. جعل 10 مل حل مثبط البروتياز والفوسفاتيز بإضافة حبة واحدة من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز إلى 10 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
    7. إعداد المخزن المؤقت هوموجيناتي الأنسجة بإضافة 4 مل حل مثبط البروتياز والفوسفاتيز إلى 50 مل محلول الأسهم السكروز 60%. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    8. إعداد تراكب المخزن المؤقت عن طريق إضافة 2 مل حل مثبط البروتياز والفوسفاتيز إلى 50 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    9. تحضير 100 مل من 1 x PBS بتمييع 10 مل من برنامج تلفزيوني x 10 في 90 مل من الماء عالي النقاوة. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    10. إعداد 10 مل من 5% بجبي بتمييع ميليلتر 500 من بجبي في مل 9.5 من الماء عالي النقاوة. استخدم حقنه 1 مل لقياس بجبي كما لزج. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    11. بارد أنابيب الطرد المركزي التالية عن طريق وضعها على الجليد: 13 مل ultracentrifuge أنابيب وأنابيب الطرد المركزي عالية السرعة 50 مل، 1.7 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب وأنابيب الطرد المركزي 15 مل.
    12. تبريد أجهزة الطرد المركزي اللازمة إلى 4 ° c: ميكروسينتريفوجي الطرد مركزي ذات قدرة عالية (بالنسبة لأنابيب 15 مل)، الطرد مركزي عالية السرعة (بالنسبة لأنابيب 50 مل) وأولتراسينتريفوجي.
  2. إعداد الأنسجة
    1. استخدم الخطوات 1.2.1–1.2.9 لإعداد الأنسجة للتجانس.
    2. إضافة 7 مل من الأنسجة الباردة هوموجيناتي المخزن المؤقت ومجانسة على الجليد بتحريك مدقة صعودا وهبوطاً 20 x. خلال السكتات الدماغية الخمسة الأولى، ضمان المدقة يذهب إلى أسفل الخالطون.
    3. نقل هوموجيناتي إلى أنبوب الطرد مركزي باردة 15 مل.
    4. شطف الخالطون مع 1 مل من الأنسجة الباردة هوموجيناتي المخزن المؤقت وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي المستخدمة سابقا 15 مل.
    5. إحضار وحدة التخزين هوموجيناتي يصل إلى 10 مل مع الأنسجة هوموجيناتي المخزن المؤقت.
    6. الطرد المركزي العينة في سعة عالية أجهزة الطرد مركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    7. نقل 8 مل من المادة طافية على أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
    8. نقل 100 ميليلتر من المادة طافية المتبقية كعينة السندات الإذنية لتحليل النقاء.
  3. التدرج السكروز
    1. إمالة أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على 8 مل من السندات الإذنية بزاوية 45 درجة. إضافة 6 مل محلول السكروز 40 ٪، ضمان البقاء المرحلتين منفصلتين بعناية.
    2. بطريقة مماثلة، ببطء إضافة 6 مل محلول السكروز 25%؛ ثم قم بإضافة 4 مل محلول السكروز 10%؛ وأخيراً، إضافة 8 مل من تراكب المخزن المؤقت.
    3. الطرد المركزي العينة في أجهزة الطرد مركزي عالية السرعة في 30,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. نقل الطبقة العليا تحتوي على دس لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل.
    5. للغسيل LD، اتبع الخطوات المذكورة في الفرع 1-4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدينا إجراء عزل LD مع عدة ER على الفئران حوالي 30 ومقارنة النتائج مع تلك التي يتبع البروتوكول عزل السكروز على ما يقرب من 40 الفئران. النتائج المبلغ عنها نموذجية لكل من البروتوكولين. وقد صام الفئران بين عشية وضحاها مع حرية الوصول إلى المياه، وزيادة غلة LD. تم تشغيل عزل LD استخدام تدرج سكروز بالتوازي مع عدة ER LD العزلة البروتوكول. عينات من السندات الإذنية، الدورة الشهرية، جمعت في، كلدس، ودس طوال الطقم ER LD العزلة البروتوكول. بسبب تقييد سير عمل البروتوكول عزل السكروز، جمعت فقط عزل السندات الإذنية ودينار.

مجهر فلوري، كانت مختلطة 50 ميليلتر من دس معزولة مع حجم متساوية من 100 ميكرومتر 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (دببدي). العينات كانت محمية من الضوء والمحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تم غسلها العينات بإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني، متبوعاً بالطرد المركزي وإزالة الزائدة في المخزن المؤقت. في كسر LD، وضعت 1 ميليلتر على شريحة المجهر، وكوفيرسليبيد. الممثل 20 x صور LD الفلورسنت وبرايتفيلد مأخوذة من عزلة طقم LD ER وعزل السكروز LD أساليب (الشكل 2 أ-د)، باستخدام مجهر مقلوب لبحث (انظر الجدول للمواد). وتكشف الصور برايتفيلد مستويات مماثلة من الجسيمات، يوحي بورتيس مماثلة باستخدام بروتوكولات مختلفة.

لتحديد الاختلافات في الإنتاجية بين البروتوكولين، استخدمنا الفئران الحجم نسبيا وكبد الماوس (الشكل 2Eوو). تم تطبيع البيانات إلى وزن الكبد (الشكل 2، ح) وتم قياس مستويات البروتين، تيراغرام LD وتنقية التالية استخدام فحوصات قياس الألوان (انظر الجدول للمواد). وجدنا، عندما نحن تطبيع بانطلاق المواد، أن البروتين LD والدرقي العائد بعد عزل LD استخدام طقم ER والسكروز مماثلة. لتحديد إذا كان حجم LD أيضا مماثلة، ونحن كمياً أقطار LD استخدام برمجيات تحليل الصورة (انظر الجدول للمواد). قديسي الأيام الأخيرة تراوحت بين 0.27 إلى 6.37 ميكرومتر. ويبين توزيع التردد القطر LD أن عزلة طقم LD ER (الشكل 3A) وعزله LD السكروز (الشكل 3B) تسفر عن LDs أحجام مماثلة.

تقييم نقاوة LD، كانت جزيئي العينات التي إيمونوبلوتينج. وكان جزيئي مبلغاً قدرة 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. وقد سبر العينات مع علامات جسم LDs (PLIN2 و PLIN3) و ER (Sec61)، الميتوكوندريا (فداك)، ليسوسوميس (LAMP1)، غشاء البلازما (MEK1)، نوى (هيستون H3) وسيتوسول (جابده) (الشكل 4 أ). تم الكشف عن PLIN2 في جميع العينات باستثناء طقم ER LD العزلة في والسندات الإذنية السكروز. قديسي الأيام الأخيرة المستمدة من الطقم ER LD العزلة والسكروز التدرج البروتوكول سواء كان النقاء متساوية. ظهرت لا نطاقات للائحة (Sec61)، الميتوكوندريا (VDAC1)، ليسوسوميس (LAMP1)، وغشاء البلازما (Mek1) أو سيتوسول (جابده). وكان مركز التنمية المحلية غشاء البلازما والتلوث سيتوسول لكن لا تلوث الظاهر من ER أو الميتوكوندريا، أو ليسوسوميس. كثافة الفرقة PLIN2 في البروتوكول ER تكييف يشير إلى أن البروتوكول ER تعبير PLIN2 أعلى معدل تقريبا في الكسر دينار مقارنة مع السندات الإذنية، بينما كان البروتوكول السكروز تعبير PLIN2 أعلى ستة إضعاف في (كسر LD البيانات لا تظهر).

لأن هذا البروتوكول أيضا لديه الخيار لتنقية ER و lysosomes، أجرينا أيضا النشاف الغربية لتقييم نقاء هذه العضيات. يبين الشكل 4 باء أن كيت إيمونوبلوتس ER المنقي من نفس العينة باستخدام لائحة (انظر الجدول للمواد) كانت خالية من PLIN2 ولكن بمستويات كبيرة من البروتين ER Sec61A. استخدام تخصيب الليزوزومية كيت (انظر الجدول للمواد)، وكانت lysosomes أخرى معزولة وإيمونوبلوتيد دينار (PLIN2) ولائحة (Sec61A)، وعلامات يحلول (LAMP1) (الشكل 4). معا، هذه البيانات تبين أن البروتوكول المعروضة هنا، في تركيبة مع مجموعات تنقية يحلول المتاحة تجارياً، والسماح لعزل نقية من الكبد LDs و ER lysosomes من حيوان مفردة.

Figure 1
الشكل 1: مرجع الصور التي التقطت خلال دينار عزل باستخدام مجموعة مواد عزل ER . (أ) ملم 5 مكعبات الكبد قطعة في 5 سم طبق بيتري. (ب) هوموجيناتي الكبد بعد تحقيق التجانس في الخالطون دونس. (ج) هوموجيناتي الكبد بعد الطرد المركزي في 1,000 س ز؛ ملاحظة طبقة الدهن طفيف على أعلى، والسندات الإذنية وبيليه الذي يحتوي على خلية الحطام والكسر النووية. (د) دينار طبقة بعد تنبيذ فائق في 100,000 س ز؛ ملاحظة الطبقة الدهنية البارزة على أعلى وفي كسر ER في الجزء السفلي. (ﻫ) LD يغسل الكسر قبل الإزالة النهائية لبرنامج تلفزيوني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: صورة مجهرية وتحليل كمي مقارنة الكسر LD معزولة مع مجموعة ER والكسر LD معزولة مع السكروز. الممثل 20 x صورة مجهرية الفلورسنت (أ) كسر LD الملطخة دببدي معزولة مع مجموعة ER ومعزولة مع السكروز قديسي الأيام الأخيرة (ب). (ج) برايتفيلد صورة مجهرية الكسر LD معزولة مع طقم ER و (د) الكسر LD معزولة مع السكروز. شريط المقياس = 20 الماوس الوزن ميكرومتر. (ه) و (و) وزن الكبد. (ز) تيراغرام العائد من المنقي LDs تطبيع لوزن الكبد. البروتين (ح) العائد من المنقي LDs تطبيع لوزن الكبد. تكون البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (N = 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: توزيع الترددات لأحجام LD. كانت ملطخة عينات من الفئران مختلفة أربعة دببدي والممثل x 20 حقول تم تحديده كمياً. وقيست الأقطار باستخدام برنامج تحليل صورة. (أ) توزيع الترددات (جزء) من جزء LD معزولة باستخدام أية مجموعة. (ب) توزيع الترددات (جزء) من جزء LD معزولة استخدام السكروز الكثافة المتدرجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحليل LD النقاء من إيمونوبلوتينج- (أ) مقارنة تكييف العزلة طقم LD ER والبروتوكول في السكروز العزلة، 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة تم إيمونوبلوتيد. تم تحميل العينات التالية: المادة طافية بوستنوكلير (السندات الإذنية) والمادة بوستميتوتشوندريال طافية (PMS) والمادة طافية الشبكة بوستيندوبلاسميك (في)، LDs الخام (CLD) و "قديسي الأيام الأخيرة" (دينار). وكانت عينات إيمونوبلوتيد LDs (PLIN2 و PLIN3)، ER (SEC61A)، الميتوكوندريا (VDAC1)، يحلول (LAMP1)، وغشاء الخلية (MEK1)، ونوى (هيستون H3) وعلامات سيتوسول (جابده). (ب) بروتوكول تحليل النقاء كسر ER بعد مزيد من تنقية لائحة استخدام عزل مجموعة LD ER (انظر الجدول للمواد). السندات الإذنية، والدورة الشهرية، حملت ER، ودس وإيمونوبلوتيد لقديسي الأيام الأخيرة (PLIN2) ولائحة (SEC61A). (ج) بروتوكول تحليل نقاء الكسر الليزوزومية بعد تنقية المزيد من lysosomes باستخدام مجموعة إثراء يحلول (انظر الجدول للمواد). حملت السندات الإذنية وكسر الليزوزومية وإيمونوبلوتيد لقديسي الأيام الأخيرة (PLIN2) و ER (SEC61A) ليسوسوميس (LAMP1). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويجري يتزايد الاعتراف كبدي LD البيولوجيا كمنظم حرجة لفسيولوجيا سرطانه الخلية في الصحة والمرض. العضيات حسنة النية، LDs ديناميكية، تتفاعل مع غيرها من الهياكل الخلوية، وتحتوي على داخل المكونات النشطة بيولوجيا لهم المشاركة في التوازن في الدهون والسكر. تستخدم بشكل روتيني لعزل LD التدرج السكروز وتمكن المحققون على دراسة هيكل LD، لكنه يتطلب منهم بذل العديد من المخازن المؤقتة. وقد أثبتنا أن استخدام مجموعة العزلة ER المتاحة تجارياً هو أداة أخرى يمكن استخدامها لعزل LD ليس فقط ولكن لعزل ER ويحلول، جنبا إلى جنب مما يتيح الحصول على عرض أكثر شمولاً من ديناميات الخلوية ردا على اختلاف الظروف التجريبية، دون زيادة كبيرة في سير العمل.

أن قوة هذا البروتوكول الجديد هو سهولة الإعداد باستخدام تجارياً أو الكواشف متاحة بسهولة وفي قدرتها على عزل العضيات متعددة في وقت واحد. ومع ذلك، هناك العيوب المحتملة لهذا الأسلوب الجديد أن نأخذ في الاعتبار. عدة خطوات في هذا البروتوكول قد تسيء إلى عزلة LDs الحجم الضخم من الكبد. تجانس دونس لديه القدرة على زعزعة LDs الكبيرة عن طريق إجهاد القص. فضفاضة المناسب دونس الخالطون الإعداد قد تخفف من بعض الضغوط لقديسي الأيام الأخيرة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، يعمل 100,000 س ز تدور، مما يسمح لفصل LD و ER. قد تسبب هذه السرعة أيضا خسارة كبيرة قديسي الأيام الأخيرة، كما يوصي التقرير واحد 2,000 س ز ل تنقية LD الكبد2. واحد الحد من هذا الإجراء أنه لا يمكن استخدامه لعزل LDs ذات أحجام مختلفة كما وصفت ذلك مؤخرا16. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن السكروز المخازن المؤقتة يمكن أن تبقى هشة LDs سليمة من خلال استخدام تجانس لطيف2، المجانسة مع العازلة IE x 1 غلة LDs النقية مع مورفولوجيا مماثلة، وحجم التوزيع كتلك المستمدة من عزل السكروز التدرج . وسوف يلزم إجراء مزيد من الدراسة لتحديد إذا كان النشاط البيولوجي يتأثر باستخدام مخزن مؤقت برنامج تلفزيوني، ولطيف أقل مما يشيع استخدام المخازن المؤقتة متساوي التوتر2. وبسبب هذه القيود المحتملة، من الأهمية بمكان أثناء الخطوات الأولى اثنين من أجهزة الطرد المركزي تماما ريسوسبيند الدهنية التي تم جمعها في الأعلى قبل نقل المادة طافية وتحديد أثر عدد السكتة الدماغية على المحصول LD تجريبيا مختلفة الأنسجة. يستخدم البروتوكول الكبد المعروضة هنا 20 السكتات الدماغية، مما أسفر عن توزيع حجم مماثل ل الأعمال المنشورة الأخرى2.

عزل LD استخدام مواد العزل هيولى غلة يعزل دينار كل من النفط الخام ونقية. يعزل مركز التنمية المحلية تحتوي على غشاء الخلية ومكوناتها سيتوسول ولكن قد تكون كافية لبعض التطبيقات، مثل تقييم LD مورفولوجيا مع مجهرية. عزل LD الصرفة، كما يحددها التعبير PLIN2، يفتقر إلى ER أو غشاء الخلية الميتوكوندريا، الليزوزومية، أو تلوث سيتوسول. وفي الواقع، يثري عزل نقية من الطقم ER LD العزلة بروتوكول PLIN2 أكثر من الضعف مقارنة مع أسلوب عزل السكروز LD. كان هذا الفرق غير متوقع، نظراً للتشابه في البروتين والدرقي العائد، ولكن قد يكون بسبب استخدام برنامج تلفزيوني كمخزن مؤقت استثارة بدلاً من السكروز أو المخزن المؤقت متساوي التوتر.

LD عزلة بالطرق التقليدية يمكن أن تعاني أيضا من تلوث الكسر LD من غشاء البلازما2. على الرغم من أن هذه العزلة المشارك هو شائع في جميع أساليب العزل LD وينبغي أن يوضع في الاعتبار عند تحليل LD يعزل2، البيانات المقدمة هنا إثبات أن تنبيذ فائق مزيد من عزل مركز التنمية المحلية العينة من هذه الملوثات ( يخلص 4 الشكل). التعديلات المقبلة يمكن أن تشمل استخدام الصحافة الفرنسية أو عزل قنبلة النيتروجين تعطيل غشاء الخلية أكثر بلطف وكذلك الحد من أي تلوث لمركز التنمية المحلية2.

وفي الختام، الطقم ER أسلوب العزل LD تطبيق رواية لأداة شائعة الاستخدام البيولوجيا الخلوية. هذا الأسلوب يقوم بالمثل لعزل السكروز التدرج، مع إعداد كاشف أقل. وباﻹضافة إلى ذلك، يحسن إدراج الكواشف المعدة في الطقم ER LD العزلة البروتوكول بالصرامة وإمكانية تكرار نتائج الظروف التجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتور كار يتلقى دعم البحوث من "اعتراض المستحضرات الصيدلانية".

Acknowledgments

ونحن نشكر معهد بحوث السرطان الأسرة ابرامسون. يتم دعم هذا العمل بالمنح التالية: المعاهد الوطنية للصحة/نياا R01 AA026302-01، والمعاهد الوطنية للصحة/نياا K08-AA021424، مؤسسة روبرت وود جونسون، هارولد آموس الطبية كلية التنمية جائزة، 7158، إيدوم جمهورية الكونغو الديمقراطية الطيار جائزة P30 DK019525 (R.M.C.)؛ المعاهد الوطنية للصحة/نياا F32-AA024347 (كيركراده). وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة P30-DK050306 ومرافقها الأساسية (الباثولوجيا الجزيئية والتصوير، والبيولوجيا الجزيئية/الجينات التعبير الأساسية، خلية الثقافة الأساسية و) وقائدها منح البرنامج. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).

Tags

علم الأحياء، العدد 146، الدهن الحبرية العزلة، الكبد، بيريليبين 2، هيولى، السكروز استخراج التدرج، ومتساوي التوتر المخزن المؤقت
دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter