Rask Lipid slippverktøy isolasjon protokollen bruker en Well-established Organelle isolering Kit

Forskning på lipiddråpebiologi har blitt hindret av vanskeligheter med rensing. I tillegg krever studier av cellulær lipidfluks samtidig rensing av flere organeller, og ingen enkle protokoller var tilgjengelige for øyeblikket. Den største fordelen med denne teknikken er å gjøre lipid dråpe rensing mer tilgjengelig.

Vi endret et kommersielt tilgjengelig sett for samtidig å isolere lipiddråper, endoplasmaisk reticulum og lysosomer fra en enkelt prøve. Lever lipid dråpe akkumulering predisponerer overvektige og alkoholholdige pasienter til progressiv leversykdom. Dette har forskjøvet synet på lipiddråper fra inerte oppbevaringsrom til dynamiske biologisk viktige organeller.

Til å begynne med, bruk sterile tang og disseksjonsaks for å kutte huden og muskellagene i magen til den eutaniserte musen på den bakre fremre aksen, utsette leveren. Kutt leddbåndene som forbinder leveren til tarmen. Bruk tang, trekk tarmen bort fra leveren, mot bakre.

Kutt ligamentet som forbinder leveren til membranen. Deretter kuttes mellom leveren og dorsal ribcage, beveger seg fra fremre til bakre, til leveren er frigjort. Overfør leveren til en kald fem centimeter petriskål med 10 milliliter kald 1x PBS, og vask leveren to ganger på en gyngeplattform i 10 milliliter kald 1x PBS i fem minutter ved fire grader Celsius.

Etter den endelige vasken, hell av 1x PBS, og bruk et størrelse-10 sterilt kirurgisk blad for å terninger leveren i tre til fem millimeter stykker i parabolen. Deretter vasker du den terninger leveren to ganger med 10 milliliter kald 1x PBS i fem minutter ved fire grader Celsius. Dekantere 1x PBS, og overføre terninger leveren stykker til en kald 45-milliliter Dounce homogenisator, slik at alle brikkene er på bunnen.

Tilsett syv milliliter kald 1x IE-buffer. Homogeniser på is ved å flytte pestle opp og ned 20 ganger, og pass på at pestle går til bunnen av homogenisatoren under hvert slag. Overfør homogenatet til et kaldt 15-milliliter sentrifugerør.

Skyll homogenisatoren med en milliliter kald 1x IE-buffer, og legg den til resten av homogenatet. For å fjerne kjerner, sentrifuger homogenatet i en høykapasitets sentrifuge ved 1000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Sørg for at en lipid samlet på toppen av 15-milliliter røret er resuspended for å hindre LD tap.

Pass på at kjernefysisk pellet på bunnen av røret er uforstyrret, overføre lipid-inneholdende post-nukleal supernatant til en frisk kald 50-milliliter sentrifuge rør. Overfør en 100-mikroliter aliquot av post-nukleær supernatant til en kald 1,7-milliliter mikrocentrifuge tube på is for senere renhet analyse. For å fjerne mitokondrier, sentrifuger den post-nuklende supernatante prøven i en nedkjølt høyhastighets sentrifuge ved 12 000 ganger g i 15 minutter ved fire grader Celsius.

Sørg for at enhver lipid samlet på toppen av røret er resuspended for å hindre LD tap, og deretter overføre post-mitokondrie supernatant til en 13-milliliter ultracentrifuge tube. Overfør en 100-mikroliter aliquot av post-mitokondriesupernatant til en kald 1,7-milliliter mikrocentrifuge tube på is for senere renhet analyse. Fyll ultracentrifuge-røret med post-mitokondrieovernande til randen med kald 1x IE-buffer, for å forhindre at det kollapser under ultracentrifugation.

Balansere prøvene, og deretter sentrifuge i en ultracentrifuge på 100, 000 ganger g i 60 minutter ved fire grader Celsius. For å fjerne LD-laget, vipp røret i en 45-graders vinkel, og aspirer med en glasspipette. Etter å ha overført pelleten til et kaldt 1,7 milliliter mikrocentrifugerør, samle 100 mikroliter av post-ER supernatant under lipidlaget for renhetsanalyse.

For å pellet noen celle rusk, sentrifuge i en mikrocentrifuge i toppfart i fem minutter på fire grader Celsius. Varm deretter røret forsiktig med hendene for å hjelpe til med å bruke LD-laget på nytt, og overfør det overnaturlige, inkludert lipidlaget, til et nytt 1,7-milliliter mikrocentrifugerør. Gjenta disse vasketrinnene, varmer røret to til tre ganger, til pelleten ikke lenger er synlig.

Deretter, for å vaske pellet-fri LD supernatant, tilsett 1x PBS til et endelig volum på 1,5 milliliter, og sentrifuge i en mikrocentrifuge i topphastighet i fem minutter ved fire grader Celsius. Bruk en glasspipette til å fjerne en milliliter 1x PBS, som er under lipidlaget, uten å forstyrre lipidlaget. Gjenta LD vask fire til fem ganger, til 1x PBS er visuelt gjennomsiktig uten turbiditet.

Bruk deretter en glasspipette til å fjerne alle 1x PBS under lipidlaget, og bruk den resulterende rene LD-brøken til nedstrømsanalyse. Når representative 20x fluorescerende og brightfield LD bilder ble tatt fra både ER kit LD isolasjon og sukrose LD isolasjon metoder, avslørte de lignende nivåer av svevestøv, noe som tyder på lignende renhet ved hjelp av to forskjellige protokoller. Etter rensing ble LD triglyserid og proteinnivåer målt ved hjelp av kolorimetriske analyser, og dataene ble normalisert til levervekt, noe som viste at når startmaterialet ble normalisert, var LD triglyserid og proteinavlinger lik ved hjelp av ER-settet og sukrosemetoden.

LD-diametere ble kvantifisert ved hjelp av bildeanalyseprogramvare, som viser at ER kit LD isolasjon og sukrose LD isolasjon ga LDer av lignende størrelser. For å vurdere LD renhet ble prøvene analysert ved immunoblotting, som viser at LDene avledet fra ER kit LD-isolasjonen og sukrosegradientprotokollen begge hadde lik renhet. PLIN2, en LD-markør, ble påvist i alle prøver unntatt ER-settet LD isolasjon PER og sukroseens PNS.

Renhetsanalyse av en ER-brøk ved hjelp av immunoblots viser at de var fri for LD-markør PLIN2, men hadde betydelige nivåer av ER SEC61A-proteinet. Renhet av en lysosomal fraksjon etter videre rensing av lysosomer ved hjelp av lysosomet berikelse kit ble også vurdert. Discovery er for tiden den mest nyttige anvendelsen av vår protokoll.

Vi utfører lipidomikk i rensede organeller, og viste lipotoksiner økes spesielt i lipiddråper i alkoholisk leversykdom.