Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Snabb Lipid Droplet isolering protokoll använder en väletablerad organell isolering Kit

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll fastställs en ny metod för lipid droplet isolering och rening från mus lever, med en väletablerad endoplasmatiska retiklet isolering kit.

Abstract

Lipid droppar (LDs) är bioaktiva organeller som finns i cytosolen i de flesta eukaryota och vissa prokaryota celler. LDs består av neutrala lipider inneslutna av en enskiktslager av fosfolipider och proteiner. Nedsatt LD lipider, till exempel ceramider och proteiner är inblandad i flera av de sjukdomar som orsakar leversteatos. Även om föregående metoder har fastställts för LD isolering, de kräver en tidskrävande beredning av reagens och är inte avsedda för isolering av flera subcellulär fack. Vi försökt att etablera ett nytt protokoll om du vill aktivera isolering av LDs, endoplasmatiska nätverket (ER) och lysosomer från en enkel mus lever.

Ytterligare, alla reagenser som används i det protokoll som presenteras här är kommersiellt tillgängliga och kräver minimal REAGENSBEREDNING utan att offra LD renhet. Här presenterar vi data som jämför detta nya protokoll till en standard sackaros gradient protokoll, visar jämförbara renhet, morfologi och avkastning. Dessutom kan vi isolera ER och lysosomer använder samma prov, som ger detaljerad insikt i bildandet och intracellulära flux av lipider och deras associerade proteiner.

Introduction

LDs är bioaktiva organeller som finns i cytosolen av de flesta eukaryota celler och vissa prokaryota celler1,2,3. LD kärnan består av neutrala lipider som triglycerider (TG) och kolesterol estrar. De innehåller också ceramider, bioaktiva lipider inblandade i cellulär signalering vägar4,5. LDs är omgiven av en fosfolipid enskiktslager och belagda med proteiner, inklusive den perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) och 3 (PLIN3)1,5,6. Också närvarande är lipogenic enzymer, lipaser och människohandel membranproteiner som har kopplats till flera nedsatt steatotic sjukdomar, inklusive alkoholfria fettlever, alkoholhaltiga leversjukdom och hepatit C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs är tänkt att bilda från det yttre membranet av ER och innehåller nya syntetiserade TG från ER-derived fria fettsyror11. Det är dock fortfarande okänt om de poolade lipider bud, vara ansluten eller är censurerade från ER6,11, att göra isoleringen av LDs fri från ER tekniskt utmanande. Fria fettsyror kan befrias från LDs genom inverkan av surface lipaser för energiproduktion eller membran syntes. LDs kan dessutom brytas via lipophagy som en reglerande mekanism och att producera fria fettsyror12.

Förutom ER och lysosomer, finns det andra organeller — såsom mitokondrier, endosomes, peroxisomes och plasmamembranet — som finns inom nära sammanslutning av LDs11. Denna snäva månggifte gör det svårt att utföra en ren LD-extraktion. Dock kan neutrala lipider medfödd låg densitet utnyttjas via centrifugering5.

Traditionellt, att LDs har isolerats med en sackaros täthet lutning1,5,13. Dessa metoder har dock inte utformats för att isolera andra organeller. Dessutom kräver de tidskrävande beredning av reagens. Detta protokoll anpassar en kommersiellt tillgänglig ER isolering kit (se Tabell för material) för att möjliggöra LD isolering. Vi använder utvinning bufferten som tillhandahålls av satsen, att lägga till ett LD isolering steg. Dessutom kan protokollet också användas för ER och lysosomala isolering använder samma proverna, vilket möjliggör en mer heltäckande bild av LDs livscykel. För att validera denna nya metod, assay vi LD avkastning, morfologi, storlek och renhet. Vi jämför de resultat som presenteras här som erhålls med ett allmänt använda protokoll som utnyttjar en sackaros gradient i LD isolering.

Vi använde en 10 - till 12-vecka-gammal, 20 g kvinnliga C57BL/6 mus fastar 16 h (mat borttagning vid 17.00 9.00 LD isolering tid) med fri tillgång till vatten. Den typiska avkastningen för TG är 0,6 mg/g lever, och för LD protein, det är 0,25 mg/g lever. Detta ger tillräckligt med material för ~ 10 immunoblots av SDS. Protokollet nedan beskriver de reagens som används och ett protokoll som är lämplig för en enda 1 g lever. Sackaros gradient isolering protokollet är anpassad från Sato14 och Wu15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes på en arbetsbänk med personlig skyddsutrustning som är lämplig för biosäkerhet nivå 1, inklusive en labbrock, handskar och skyddsglasögon. Experimenten utfördes enligt de protokoll som godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Pennsylvania. Alla ansträngningar har gjorts att minimera djurens obehag, och djuren behandlades med mänsklig omsorg.

1. LD isolering med en ER isolering kit

  1. Beredning
    Obs: De angivna belopp är lämpliga för en enda 1 g mus lever.
    1. Förbereda 10 mL 1 x isoton utvinning buffert (IE buffert, från ER isolering kit) genom att späda ut 2 mL 5 x IE buffert med 8 mL av ultrarent vatten. Cool bufferten genom att placera det på is.
    2. Bereda 100 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att späda 10 mL 10 x PBS i 90 mL ultrarent vatten. Cool det genom att placera det på is.
    3. Förbereda 10 mL 5% polyetylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl eter (PGPE) genom att späda 500 µL av PGPE i 9,5 mL ultrarent vatten. Använd en 1 mL spruta för att mäta ut PGPE som det är trögflytande. Cool det genom att placera det på is.
    4. Cool alla rör genom att placera dem på is: 1,7 mL mikrocentrifugrör, 15 mL centrifugrör, 50 mL centrifugrör som höghastighetståg och 13 mL ultracentrifugen rör.
    5. Cool alla nödvändiga centrifuger till 4 ° C: en mikrocentrifug, en hög kapacitet centrifug för 15 mL-rör en höghastighets centrifug för 50 mL rör och en ultracentrifugen.
    6. Sterilisera sax pincett och dissektion i autoklav.
  2. Vävnad förberedelse
    1. Avliva musen genom att placera det i en kammare fylld med 100% CO2 för 10 min. bekräfta dödshjälp genom att utföra cervikal Dislokation.
    2. Med hjälp av steril pincett och dissektion sax, klippa hud och muskel lagren av buken på den bakre/främre axeln att exponera levern.
    3. Skär de ligament ansluta levern till diafragma och tarmen. Använda pincett för att dra tarmen från levern, mot den bakre, att exponera ligament.
    4. Skär mellan levern och dorsala bröstkorgen, flytta från främre till bakre tills levern är befriat.
    5. Överföra levern till en kall 5 cm petriskål med 10 mL kallt 1 x PBS.
    6. Tvätta levern 2 x på en gungande plattform i 10 mL kallt 1 x PBS för 5 min vid 4 ° C i 5 cm petriskål. Häll av 1 x PBS efter den sista tvättningen.
    7. Använd en storlek-10 sterila kirurgiska blad (se Tabell för material) till tärna levern i 3 – 5 mm bitar i 5 cm petriskål (figur 1A).
    8. Tvätta den tärnade levern 2 x med 10 mL kallt 1 x PBS för 5 min vid 4 ° C i 5 cm petriskål.
      Obs: För Lysosomen isolering, överföra 0,5 g i levern till en ren 45 mL Homogenisatorer och följ anvisningarna av Lysosomen utvinning kit (se Tabell för material).
    9. Dekantera 1 x PBS och överföra tärnad lever bitar till den kalla 45 mL Dounce Homogenisatorer. Säkerställa alla bitar går till botten av homogenisatorn.
    10. Tillsätt 7 mL kallt 1 x IE buffert (från ER isolering kit) och homogenisera på is genom att flytta mortelstöten upp och ner 20 x. Säkerställa att mortelstöten går till botten av homogenisatorn under varje stroke.
    11. Överföra Homogenatet (figur 1B) till ett kallt 15 mL centrifugrör.
    12. Skölj homogenisatorn med 1 mL kallt 1 x IE buffert (från ER isolering kit) och tillsätt detta till resten av Homogenatet.
  3. LD isolering
    1. Ta bort kärnor genom centrifugering Homogenatet i en hög kapacitet Centrifugera vid 1 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C (figur 1 c).
    2. Överföra postnuclear supernatanten (PNS) till en ny, kall 50 mL centrifugrör. Förhindra förlust av LD, säkerställa att eventuella lipid samlades på toppen av 15 mL röret är resuspended innan du överför PNS.
    3. Ta en 100 µL delmängd av PNS renhet analysi och placera den i ett kallt 1,7 mL mikrocentrifug rör. Ställ den åt sidan på isen.
    4. Ta bort mitokondrier, Centrifugera PNS provet, inte alikvoten, i en kyld höghastighetståg Centrifugera vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
      1. Tillval: för råolja LD (CLD) isolat (med cytosol och cellmembranet kontaminering), samla in övre lipidskiktet med glas pipett och överföra det till ett 1,7 mL mikrocentrifug rör. Fortsätt till avsnitt 1.4.
    5. Överföra postmitochondrial supernatanten (PMS) till en ultracentrifugen röret. Förhindra förlust av LD, säkerställa att eventuella lipid samlades på toppen är resuspended innan du överför PMS.
    6. Ta en 100 µL delmängd av PMS för renhet analys och placera den i ett kallt 1,7 mL mikrocentrifug rör. Ställ den åt sidan på isen.
    7. Fyll en ultracentrifugen röret till brädden med kall 1 x IE buffert för att förhindra att röret kollapsar under ultracentrifugering.
    8. Balansera proverna och centrifugera dem i en ultracentrifugen vid 100 000 x g i 60 minuter vid 4 ° C (figur 1 d).
    9. Ta bort LD lagret, luta tuben i 45° vinkel och använda glas pipett för att aspirera. Överföra pelleten till ett kallt 1,7 mL mikrocentrifug rör.
      Obs: Pelleten innehåller isolerade ER. Använd denna fraktion nedströms för ER isolering.
    10. Samla 100 µL av post-ER supernatanten (PER) under lipidskiktet för renhet analys.
  4. LD tvätt
    1. Lägga till 1 x PBS LD fraktionen samlas i en 1,7 mikrocentrifug rör, till en total volym på 1,3 mL.
    2. Vortex provet.
    3. Centrifugera i en mikrocentrifug på högsta hastighet i 5 minuter vid 4 ° C till pellet cell skräp. Varma röret försiktigt med händerna för att resuspendera LD lagret. Överför supernatanten, inklusive lipidskiktet, till ett nytt 1,7 mL mikrocentrifug rör.
    4. Upprepa steg 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, tills pelleten är inte längre synlig.
    5. Lägga till 1 x PBS supernatanten till en slutlig volym av 1,5 mL pellet-gratis LD. Tvätta det lipid bråket genom centrifugering i en mikrocentrifug på högsta hastighet i 5 minuter vid 4 ° C.
    6. Ta bort 1 mL 1 x PBS (under lipidskiktet) med glas pipett utan att störa lipidskiktet.
    7. Upprepa steg 1.4.5 och 1.4.6 4 x-5 x, tills 1 x PBS är visuellt transparent med ingen grumlighet.
    8. Ta bort alla 1 x PBS under lipidskiktet, med glas pipett (figur 1E).
    9. Använd resultatet, en ren LD bråkdel, för efterföljande analys.
  5. LD protein kvantifiering av bicinchoninic acid test
    Obs: Använd inte en bicinchoninic acid test (BCA) om LD morfologi skall bedömas.
    1. Återsuspendera LD i 500 μL av 5% PGPE.
    2. Koka proverna för 5 min vid 95 ° C, vortex, och inkubera proverna för 5 min svalna i rumstemperatur.
    3. Upprepa steg 1.5.2 ett ytterligare 2 x.
    4. Sonikera proverna för 5 min med en 30 s/på cykel, med medelhög intensitet.
    5. Normalisera proverna genom att mäta protein koncentrationen i alla renhet analys prover och i LD fraktionen med BCA assay.

2. LD isolering använder sackaros täthetlutning

  1. Beredning
    1. Gör 200 mL TE buffert (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Cool det genom att placera det på is.
    2. Gör 100 mL 60% (w/v) sackaroslösning i TE buffert genom upplösning 60 g sackaros i TE buffert, föra den slutliga volymen 100 mL. Cool det genom att placera det på is.
    3. Gör 6 mL 40% (w/v) sackaroslösning genom att lägga till 4 mL 60% sackaros 2 mL TE buffert. Cool det genom att placera det på is.
    4. Gör 6 mL 25% (w/v) sackaroslösning genom att lägga till 2,5 mL 60% sackaros 3,5 mL TE buffert. Cool det genom att placera det på is.
    5. Gör 4 mL 10% (w/v) sackaroslösning genom att lägga till 0,7 mL 60% sackaros 3,3 mL TE buffert. Cool det genom att placera det på is.
    6. Gör 10 mL proteas och fosfatas hämmare lösning genom att lägga till en tablett av både proteas och fosfatas hämmare 10 ml av TE buffert.
    7. Förbereda vävnad Homogenatet buffert genom att lägga till 4 mL proteas och fosfatas hämmare lösning 50 mL av stamlösningen 60% sackaros. Cool det genom att placera det på is.
    8. Förbereda overlay buffert genom att lägga till 2 mL proteas och fosfatas hämmare lösning 50 mL TE buffert. Cool det genom att placera det på is.
    9. Bereda 100 mL 1 x PBS genom att späda 10 mL 10 x PBS i 90 mL ultrarent vatten. Cool det genom att placera det på is.
    10. Förbereda 10 mL 5% PGPE genom att späda 500 µL av PGPE i 9,5 mL ultrarent vatten. Använd en 1 mL spruta för att mäta ut PGPE som det är trögflytande. Cool det genom att placera det på is.
    11. Cool följande Centrifugera rören genom att placera dem på is: 1,7 mL mikrocentrifugrör, 15 mL centrifugrör, 50 mL centrifugrör som höghastighetståg och 13 mL ultracentrifugen rör.
    12. Cool krävs centrifugerna till 4 ° C: en mikrocentrifug, en hög kapacitet centrifug (för 15 mL rör), en höghastighets centrifug (för 50 mL rör) och en ultracentrifugen.
  2. Vävnad förberedelse
    1. Använd steg 1.2.1–1.2.9 för att förbereda vävnaden för homogenisering.
    2. Tillsätt 7 mL kall vävnad Homogenatet buffert och homogenisera den på is genom att flytta mortelstöten upp och ner 20 x. Under de fem första stroke, säkerställa mortelstöten går till botten av homogenisatorn.
    3. Överföra Homogenatet till ett kallt 15 mL centrifugrör.
    4. Skölj homogenisatorn med 1 mL kall vävnad Homogenatet buffert och överföra den till det tidigare använda 15 mL centrifugröret.
    5. Ta med volymen av Homogenatet upp till 10 mL med vävnad Homogenatet buffert.
    6. Centrifugera provet i en hög kapacitet Centrifugera vid 1 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    7. Över 8 mL av supernatanten till en 50 mL centrifugrör.
    8. Överföra 100 µL av återstående supernatanten som PNS analysprovet renhet.
  3. Sackaros övertoning
    1. Luta den 50 mL centrifugrör som innehåller de 8 mL av PNS i 45° vinkel. Tillsätt försiktigt 6 mL av 40% sackaroslösning, som säkerställer de två faserna bo separat.
    2. På ett liknande sätt, sakta lägga 6 mL 25% sackaroslösning; Lägg sedan till 4 mL 10% sackaroslösning; Slutligen tillsätt 8 mL overlay buffert.
    3. Centrifugera provet i en höghastighets Centrifugera vid 30 000 x g vid 4 ° C i 30 min.
    4. Överföra det översta lagret som innehåller LDs till ett 1,7 mL mikrocentrifug rör.
    5. LD tvätt, Följ stegen i avsnitt 1.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har utfört LD isolering med ER kit på cirka 30 möss och jämfört resultaten med de efter protokollet sackaros isolering på cirka 40 möss. De rapportera resultaten är typiska för båda protokollen. Möss var fastat över natten med fri tillgång till vatten, att öka LD avkastningen. LD isolering använder sackaros toning kördes parallellt med ER kit LD isolering protokoll. Prover av PNS, PMS, PER, CLDs och LDs samlades hela ER kit LD isolering protokoll. På grund av arbetsflödet begränsning av protokollet sackaros isolering, endast isolatet av PNS och LD samlades.

För fluorescerande mikroskopi, 50 µL av isolerade LDs blandades med en lika stor volym av 100 µM 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Proverna var skyddas från ljus och inkuberas i rumstemperatur i 30 min. Proverna spolades genom att tillsätta 1 mL 1 x PBS, följt av centrifugering och borttagning av överflödig buffert. I bråk som LD, var 1 µL placeras på ett objektglas och ordning. Representativa 20 x lysrör och brightfield LD bilder togs från både ER kit LD isolering och sackaros LD isolering (figur 2A-D) metoder, genom en inverterad forskning Mikroskop (se Tabell för material). Brightfield bilderna avslöjar liknande nivåer av partiklar, vilket tyder på liknande föroreningar med olika protokoll.

För att avgöra skillnader i avkastning mellan de två protokollen, använde vi comparably stora möss och mus lever (figur 2EF). Följande rening, LD TG och protein nivåer mättes med hjälp av kolorimetriska analyser (se Tabell av material) och data var normaliserade till levervikt (figur 2 gH). Vi hittade, när vi normaliserade utgångsmaterialet, att LD protein och TG ge efter LD isolering med hjälp av ER kit och sackaros var liknande. Att avgöra om LD storleken också var liknande, vi kvantifieras LD diametrar med bild analys programvara (se Tabell för material). LDs varierade från 0,27 till 6,37 µm. Frekvens distribution av LD diameter visar att ER kit LD isolering (figur 3A) och sackaros LD isolering (figur 3B) avkastning LDs av liknande storlek.

För att bedöma LD renhet, analyserades proverna av immunoblotting. Ett belopp på 20 µg protein per prov var analyseras av SDS. Proverna var utforskad med antikropp markörer för LDs (PLIN2 och PLIN3), ER (Sec61), mitokondrierna (VDAC), lysosomer (LAMP1), plasmamembranet (MEK1), kärnor (Histon H3) och cytosolen (GAPDH) (figur 4A). PLIN2 påvisades i samtliga prover utom den ER kit LD isolering PER och sackaross PNS. LDs härrör från ER kit LD isolering och sackaros gradient protokollet båda hade lika renhet. Inga band visades för ER (Sec61), mitokondrierna (VDAC1), lysosomer (LAMP1), plasmamembranet (Mek1) eller cytosolen (GAPDH). Kalibrera CLD hade plasmamembranet och cytosolen kontaminering men ingen uppenbar förorening från ER, mitokondrier och lysosomer. Intensiteten av PLIN2 bandet i anpassade ER protokollet anger att protokollet ER hade cirka 14-faldigt högre PLIN2 uttryck i LD fraktionen jämfört med PNS, medan protokollet sackaros hade en sixfold högre PLIN2 uttryck i en LD bråkdel ( data som inte visas).

Eftersom detta protokoll har också möjlighet att rena ER och lysosomer, framförde vi western blotting för att bedöma dessa organeller renhet. Figur 4B visar att immunoblots av renat ER från samma prov med ER kit (se Tabell för material) var fria av PLIN2 men hade betydande nivåer av proteinet ER Sec61A. Med hjälp av lysosomala anrikningen kit (se Tabell för material), lysosomer var ytterligare isolerade och immunoblotted för LD (PLIN2), ER (Sec61A) och Lysosomen (LAMP1) markörer (figur 4 c). Tillsammans, dessa uppgifter visar att det protokoll som presenteras här, i kombination med kommersiellt tillgängliga Lysosomen rening kit, tillåt för ren isolering av levern LDs, ER och lysosomer från ett enskilt djur.

Figure 1
Figur 1: referens bilder tagna under den LD isolering med en ER isolering kit . (A), tärnad 5 mm lever bitar i en 5 cm petriskål. (B) lever Homogenatet efter homogenisering i en Dounce Homogenisatorer. (C) lever Homogenatet efter centrifugering vid 1 000 x g; Observera liten lipidskiktet på toppen, PNS och pelleten innehållande cellfragment och nukleära bråkdel. (D) LD lager efter ultracentrifugering vid 100 000 x g; Observera framstående lipidskiktet på toppen, PER, och den ER fraktionen på botten. (E), tvättat LD fraktion innan slutliga avlägsnandet av PBS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Mikrograf och kvantitativ analys jämföra andelen LD isolerade med en ER-kit och LD fraktionen isolerad med sackaros. Representant 20 x fluorescerande mikrograf av (A), en DPBDI-färgade LD bråkdel isolerad med ett ER-kit och (B) LDs isolerad med sackaros. (C) Brightfield mikrograf i bråket som LD isolerade med ER kit och (D) den LD fraktionen isolerad med sackaros. Skalstapeln = 20 µm. (E) musens vikt och (F) levervikt. (G), TG avkastning från renat LDs normaliserade till levervikt. (H) Protein avkastning från renat LDs normaliserade till levervikt. Uppgifterna är medelvärde ± SEM (N = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Frekvens distribution av LD storlekar. Prover från fyra olika möss var målat med DPBDI och representant 20 x fält kvantifierades. Diametrarna mättes med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för analys. (A) frekvens (fraktion) distribution av en LD bråkdel isolerade med ett ER-kit. (B) frekvens (fraktion) distribution av en LD bråkdel isolerade använder sackaros gradient densitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: analys av LD renhet av immunoblotting. (A) att jämföra ER kit LD isolering anpassad protokoll och protokollet isolering sackaros, 20 µg protein per prov var immunoblotted. Följande exempel lästes: postnuclear supernatanten (PNS), postmitochondrial supernatanten (PMS), postendoplasmic Retikulum supernatanten (PER), rå LDs (CLD) och LDs (LD). Prover var immunoblotted för LDs (PLIN2 och PLIN3), ER (SEC61A), mitokondrierna (VDAC1), Lysosomen (LAMP1), cellmembranet (MEK1), kärnor (Histon H3) och cytosolen (GAPDH) markörer. (B) renhet analys av en ER bråk efter ytterligare rening av ER använda ER kit LD isolering protokoll (se Tabell för material). PNS, PMS, ER och LDs lästes och immunoblotted för LDs (PLIN2) och ER (SEC61A). (C) renhet analys av en lysosomala bråkdel efter ytterligare rening av lysosomer använder Lysosomen anrikning kit protokoll (se Tabell för material). PNS och en lysosomala bråkdel lästes och immunoblotted för LDs (PLIN2), ER (SEC61A) och lysosomer (LAMP1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nedsatt LD biologi är alltmer erkänns som en kritisk regulator av hepatocellulär fysiologi i hälsa och sjukdom. Bona fide organeller, LDs är dynamiska, interagera med andra cellulära strukturer samt innehålla inom dem bioaktiva komponenter inblandade i både lipider och glukos homeostas. Toningen som sackaros används rutinmässigt för LD isolering och möjliggör utredarna att studera LD struktur, men det kräver dem att göra ett flertal buffertar. Vi har visat att användningen av ett kommersiellt tillgängliga ER isolering kit är ett annat verktyg som kan användas för inte bara LD isolering men för tandem isolering av ER och Lysosomen, vilket möjliggör en mer heltäckande bild av cellulära dynamics svar på varierande experimentella förhållanden, utan signifikant ökning i arbetsflödet.

Styrkan i detta nya protokoll är dess enkla installationen med hjälp av kommersiellt eller lättillgängliga reagenser och dess förmåga att isolera flera organeller samtidigt. Men finns det potentiella nackdelar med denna nya metod att tänka. Flera steg i detta protokoll kan missgynna isolering av supersized LDs från levern. Dounce homogenisering har potential att störa stora LDs genom skjuvspänning. Ett löst passande Dounce Homogenisatorer setup kan lindra en del av stressen att stora LDs. Dessutom, en 100 000 x g spin är anställd, vilket möjliggör separation av LD och ER. Denna hastighet kan också orsaka en förlust av stora LDs, som en rapport rekommenderar 2 000 x g för levern LD rening2. En begränsning av detta förfarande är att det inte kan användas för att isolera LDs i olika storlekar som nyligen beskriven16. Dessutom, även om sackaros buffertar kan hålla bräckliga LDs intakt genom användning av mild homogenisering2, ger homogenisering med 1 x IE buffert ren LDs med liknande morfologi och storlek distribution som de härrör från sackaros gradient isolering . Ytterligare studier behövs för att avgöra om den biologiska aktiviteten påverkas av användningen av en PBS-bufferten, vilket är mindre skonsam än vanliga isoton buffertar2. På grund av dessa potentiella begränsningar, det är viktigt under de första två centrifug stegen att fullt resuspendera den lipid samlas på toppen innan du överför supernatanten och att empiriskt fastställa effekten av antalet stroke på LD avkastningen för olika vävnaderna. Det lever protokollet som presenteras här använder 20 slag, ger en jämförbar storlek distribution till andra publicerade arbete2.

LD isolering använder endoplasmatiska retiklet isolering kit ger både rå och ren LD isolat. CLD isolat innehålla cellmembranet och cytosolen komponenter men kan visa sig vara tillräcklig för vissa program, såsom utvärdering av LD morfologi med mikroskopi. Isolatet av ren LD, saknar som bestäms av PLIN2 uttryck, ER, mitokondriell, lysosomala, cellmembranet eller cytosol kontaminering. Isolatet av ren från ER kit LD isolering protokoll berikar verkligen PLIN2 mer än dubbelt jämfört med metoden sackaros LD isolering. Denna skillnad var oväntat, tanke på likheten i protein och TG avkastning, men kan bero på användningen av PBS som en resuspension buffert i motsats till sackaros eller isoton buffert.

LD isolering av traditionella metoder kan också drabbas av kontaminering av LD fraktionen av plasmamembranet2. Även om denna samtidig isolering är vanligt i alla LD isoleringsmetoder och bör hållas i åtanke när analysera LD isolat2, de data som presenteras här visar att ytterligare ultracentrifugering av CLD isolatet rids urvalet av sådana föroreningar ( Figur 4). Framtida anpassningar kan omfatta användning av en fransk press eller kväve bomb att störa cellmembranet mer skonsamt och ytterligare minska kontaminering av CLD isolera2.

Sammanfattningsvis, är den ER kit LD isolering metod en ny tillämpning av ett vanliga cellbiologi verktyg. Denna metod utförs på samma sätt till sackaros gradient isolering, med mindre REAGENSBEREDNING. Dessutom förbättrar införandet av beredda reagens i ER kit LD isolering protokoll stringens och reproducerbarhet experimentella betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Carr får forskningsstöd från avlyssna Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Vi tackar den Abramson familj Cancer Research Institute. Detta arbete stöds av följande bidrag: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medicinska fakulteten Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Detta arbete var stöds delvis av NIH P30-DK050306 och dess corefaciliteter (molekylär patologi och Imaging Core, molekylärbiologi/Gene Expression Core och cellen kultur kärnar ur) och dess pilot bevilja program. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).

Tags

Biologi fråga 146 Lipid droplet isolering lever perilipin 2 endoplasmatiska retikulet sackaros gradient isoton extraktion buffert
Snabb Lipid Droplet isolering protokoll använder en väletablerad organell isolering Kit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter