Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette paper præsenterer en kirurgisk metode til dissekere Drosophila puppe nethinder sammen med protokoller til forarbejdning af væv til immunhistokemi, vestlige analyse og RNA-udvinding.
Transcript
Denne protokol er signifikant, fordi dette er en effektiv metode til isolering af Drosophila pupal øjenvæv til flere downstream applikationer. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for hurtig dissektion af et stort antal pupal øjne uden at beskadige vævet. Dissektion af Drosophila pusle nethinden vil være udfordrende for nybegyndere.
Øve teknikken er den bedste måde at forbedre hastigheden af dissektioner og kvaliteten af resultaterne. Efter at have placeret Drosophila pupper på en sort dissekerende fad, lå et frisk stykke dobbeltsidet tape på dissekerende parabol, væk fra pupper, og bruge et par kraftvæcesner til omhyggeligt at placere pupper dorsal side op på båndet. Placer skålen under et stereomikroskop, og brug vicesser til at fjerne operculum af hver pupper.
Brug microdissection saks til at skære hver pupal sag, gør det muligt at blive flapped åben for at afsløre hovedet, brystkasse, og forreste abdominal segment, og sikre kanterne af pupal sagen til dobbeltsidet tape. Pierce maven af hver pupper med skarpe kraftbecer, og fjerne puppen fra sin pupal sag. Læg puppen på dissektionsskålen, væk fra båndet, og dæk puppen med 400 mikroliter iskold PBS.
Brug vicess til at gribe hver enkelt af maven, og bruge microdissection saks til at gøre en ren tværsnitsnit gennem brystkassen, skære pupper i halve. Ved hjælp af to par fine stæcener, tag fat i de afskårne kanter af hver thorax epitel og gradvist rive åbne brystkassen og hoved kapsel, udsætter øjet-hjerne kompleks og det omgivende fedtvæv. Derefter, uden at gribe vævet, bruge kraftvipper til at guide hver gennemskinnelig, off-white, håndvægt-formet øjen-hjerne kompleks, væk fra resterne af hovedet kapsel.
Efter dissekering seks til 10 pupper, skære en mikropipette spids med en ren barberblad til en diameter på omkring en millimeter, og smøre spidsen med en blanding af PBS og fedt. Brug den smurte pipettespids til at overføre øjen-hjerne-komplekserne til en brønd af en ni-brønd glasskål indeholdende 400 mikroliter PBS på is, og overfør derefter vævet i 20 mikroliter PBS til mindst 250 mikroliter fiksativ for en 35-minutters inkubation på is. Ved afslutningen af fikseringen anvendes den samme pipettespids til at overføre vævet til en tredje brønd, der indeholder 400 mikroliter frisk PBS i fem til 10 minutter på is.
For at blokere enhver ikke-specifik antistofbinding skal øjenhjernekomplekserne overføres til 400 mikroliter PBS plus Triton X for en 10-til 60-minutters inkubation på is. Ved inkubationens afslutning skal der anvendes 10 mikroliter af den primære antistofopløsning i det nødvendige antal brønde på en 72-brøndmikrobåsplade, og der anvendes en P10-mikropipette med en modificeret 0,5-millimeter spids smurt med PBS plus Triton X til at overføre højst fem øjenhjernekomplekser og højst tre mikroliter PBS til hver brønd af antistofopløsning. Efter en overnight inkubation ved fire grader Celsius, vask prøverne to gange i 400 mikroliter af PBS plus Triton X i en brønd af en ni-brønd glasskål i fem til 10 minutter pr vask.
Efter den tredje vask overføres vævet til 100 mikroliter af en passende sekundær antistofopløsning i to timer ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, efterfulgt af tre 5-10 minutters vask i 400 mikroliter PBS plus Triton X og en vask i PBS. Derefter skal prøverne i ligevægt i 200 mikroliter monteringsmedium i en til to timer. I slutningen af inkubationen, overføre prøverne til et mikroskop dias, og bruge en robust wolfram nål til at fastgøre en eye-hjerne kompleks til dias under en dissekere mikroskop.
Brug derefter en fin wolfram nål til at skære hvert øje væk fra sin tilhørende optisk lap og til at manøvrere hvert øje til overfladen af mikroskop dias, således at den basale overflade af øjet støder op til diaset. Derefter anvende en ren coverslip over prøverne, og forsegle coverslip med neglelak. For at forberede pupal eye væv til western blot analyse, første dissekere 10 til 16 pupper som tidligere påvist i to partier, 10 til 15 minutter fra hinanden i PBS suppleret med protease og fosfatase hæmmere.
Efter kortvarigt at have skyllet de isolerede øjen-hjerne-komplekser to gange i individuelle brønde i en ni-brønd glasskål på is i 400 mikroliter PBS plus-hæmmere, overføres alle øjen-hjerne-komplekser til 400 mikroliter af iskolde PBS plus inhibitorer dekanteret på en ren sort dissekerende skål. Under en ren dissekere mikroskop, bruge en robust wolfram nål og en fin barberblad til rent at skære hvert øje fra den optiske lap, og bruge en smurt spids til at overføre øjen-hjerne komplekser i fem mikroliter af PBS plus hæmmere i en 500-mikroliter mikrocentrifuge rør på is. Derefter tilsættes fem mikroliter af vestlige vævslysisbuffer og 10 mikroliter af 2X koncentreret proteinprøvebuffer til røret.
At behandle øjen-hjerne komplekser til RNA ekstraktion, iført handsker, rense bordplade, mikroskop, dissekere værktøjer, og sort dissekere retter med 70% ethanol og RNase dekontaminering reagens. Efter at have ladet området tørre, dissekere i alt 30 til 40 pupper i partier på seks til otte. Efter hvert parti af øjen-hjerne komplekser er blevet dissekeret, overføre øjet-hjerne komplekser fra ni-brønd parabol i 400 mikroliter af frisk, iskold, nuklease-fri PBS på en ren dissekering fad, og bruge en robust wolfram nål og en fin barberblad til rent skære hvert øje fra den optiske lap.
Når alle øjne for et parti er fjernet, overføres de til et sterilt, RNase-frit mikrocentrifugerør og flash-freeze prøverne i flydende nitrogen, før de går videre til næste parti. Pupal øjet er et let tilgængeligt væv, der tjener som en fremragende model til undersøgelse af udviklingsprocesser, herunder dem, der driver morfogenese. Omkring 40 timer efter pupariumdannelse opnås det endelige arrangement af celler.
Dette er en ideel alder til at vurdere konsekvenserne af en genetisk mutation eller modificeret genekspression. For eksempel, efter ektopisk udtryk for Diap1, en kernehæmmer af apoptose, den deraf følgende stigning i antallet af gitterceller kan sammenlignes med den, der observeres i en kontrol nethinden. Apoptose kan også vurderes mere direkte ved at udnytte antistoffer til at aktivere en død caspase-1 eller ved hjælp af andre tilgange til påvisning af døende celler.
Western blot analyser af øjenlysater kan bruges til at bestemme tilstedeværelsen eller det relative udtryk for proteiner af interesse eller til at sammenligne proteinudtryk på forskellige udviklingstidspunkter. Det er vigtigt at bemærke, at dissekere mere end 60 øjne pr genotype eller eksperimentel tilstand er optimal til isolering af tilstrækkeligt højtstående RNA. Det vigtigste at huske er, at pupal nethinden er yderst skrøbelig, og stor omhu skal tages under dissektion for at sikre dens integritet.
Tags
Udviklingsmæssige biologi sag 145 Drosophila puppe øjet nethinden dissektion immunhistokemi Western blotting RNA udvinding mikroskopiRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
