Sauvetage du virus Zika recombinant d'un clone d'ADNc chromosomique artificiel bactérien

L’objectif global de cette procédure expérimentale est la génération du virus Zika recombinant infectieux à partir d’un clone de l’ADNC pleine longueur, assemblé dans un chromosome artificiel bactérien sous le contrôle du promoteur humain du cytomégalovirus immédiat et précoce. Le développement d’un système génétique inverse pour les virus ARN tels que le virus Zika permet la manipulation directe du génome du virus pour étudier plusieurs aspects de la biologie virale et de la pathogénie et développer une stratégie vaccinale. Le principal avantage de cette technique est que la construction du clone infectieux du virus Zika en tant que chromosome artificiel bactérien surmonte la toxicité associée au génome du flavivirus et permet le sauvetage du virus infectieux par transfection directe du clone bac cDNA en cellules sensibles.

Cette méthodologie pourrait être appliquée à la construction de clones infectieux stables et entièrement fonctionnels de l’ADND pour d’autres flavivirus ainsi que d’autres virus arn à brin positif. Pour commencer cette procédure, construisez le clone cDNA du virus Zika tel qu’il est décrit dans le protocole textuel, à l’aide de sites de restriction appropriés. Quatre fragments d’ADN couvrant le génome du virus Zika flanqués du promoteur humain du CMV à l’extrémité à cinq premiers et du virus de l’hépatite delta ribosome et des séquences d’arrêt et de polyadenylation de l’hormone de croissance bovine à l’extrémité à trois premiers sont assemblés dans un plasmide chromosomique artificiel bactérien.

Tout d’abord, cultiver une seule colonie d’E.coli DH10B transportant le clone infectieux du virus pBAC-Zika en cinq millilitres de milieu LB contenant du chloramphéniphénol pendant huit heures à 37 degrés Celsius avec des secousses douces. Ensuite, ajouter 500 millilitres du milieu LB contenant du chloramphénicol à un flacon de deux litres. Ajouter un millilitre de la culture bactérienne préparée au flacon et faire croître les cellules à 37 degrés Celsius pendant 14 à 16 heures jusqu’à ce que l’OD600 soit d’environ 0,6 à 0,8.

Après cela, utilisez un kit commercial spécialement développé pour la purification bac pour purifier l’infection BAC clone cDNA par lyse alcaline en suivant les instructions du fabricant. Un jour avant la transfection, plaquez les cellules vero dans les puits d’une plaque de six puits à une densité de 500 000 cellules par puits en milieu de croissance. Pour préparer le mélange de transfection, ajouter quatre microgrammes du clone bac cDNA à 250 microlitres de sérum réduit moyen et mélanger soigneusement.

Dans un tube séparé, diluer 12 microlitres d’agent transfection dans 250 microlitres de sérum réduit moyen. Vortex pour mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, combinez le BAC dilué cDNA avec l’agent transfection.

Mélanger soigneusement et incuber à température ambiante de 20 à 30 minutes. Pendant cette période d’incubation, utiliser un milieu de croissance sans antibiotiques pour laver les cellules Vero et laisser les cellules dans un millilitre de milieu frais sans antibiotiques. Ensuite, distribuez les 500 microlitres du mélange de réaccène et de réaccfection transfection sur les cellules vero dropwise.

Rock la plaque d’avant en arrière pour mélanger et incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Après cela, retirer le milieu de transfection et ajouter deux millilitres de milieu de croissance frais avec des antibiotiques. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant de vérifier chaque jour pour l’induction de l’effet cytopathique.

Après quatre à six jours de transfection, lorsque le CPE est d’environ 50 à 75% recueillir les supernatants de culture tissulaire dans des tubes coniques de 15 millilitres et centrifugeuse pendant 10 minutes pour enlever les débris cellulaires. Ensuite, récoltez les supernatants contenant le virus Zika recombinant et jetez les granulés cellulaires. Aliquot le supernatant en cryotubes et les stocker à moins 80 degrés Celsius.

Pour commencer, faire croître les cellules vero à 90% de confluence. Lavez les cellules deux fois avec PBS et infectez-les avec le virus sauvé avec la multiplicité de l’infection de 0,1 dans le milieu de croissance contenant 2%FBS. Placez les plaques des cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et de roche toutes les 15 minutes pendant la période d’adsorption de 90 minutes.

Après l’adsorption virale, enlever l’inoculum viral et ajouter un milieu de croissance frais avec 2%FBS. Incuber trois ou quatre jours aux mêmes conditions utilisées précédemment. Lorsque le CPE est d’environ 75%recueillir la culture tissulaire supernatant et centrifugeuse pour enlever les débris cellulaires.

Ensuite, récoltez le supernatant contenant le virus Zika recombinant et jetez la pastille. Aliquot le supernatant en cryotubes. Placez les tubes dans une boîte de congélation et rangez-les à moins 80 degrés Celsius.

Une fois prêt, retirez un virus aliquot du congélateur et déterminez le titer viral par analyse de plaque tel que décrit dans le protocole de texte. Dans cette étude, un clone stable et complet de l’ADNC de la souche du virus Zika Rio Grande do Norte Natal est généré par le clonage séquentiel de quatre fragments d’ADNC qui se chevauchent dans le chromosome artificiel bactérien pBeloBAC11 à l’aide de méthodes de clonage conventionnelles et de sites de restriction uniques présents dans le génome viral. Ce clone cDNA pleine longueur a été flanqué à l’extrémité à cinq premiers par le promoteur humain de cytomégalovirus pour permettre l’expression de l’ARN viral dans le noyau des cellules transfected et à l’extrémité de trois-prime par le ribosome de virus de delta d’hépatite suivi de l’arrêt d’hormone de croissance bovine et de la séquence de polyadenylation pour produire des ARN contenant l’extrémité trois-prime exacte du génome viral.

Une fois l’ADNC BAC assemblé, le virus infectieux peut être facilement récupéré après la transfection directe des cellules Vero sensibles avec le clone bac cDNA à l’aide de liposomes cationiques. Grâce à cette approche, le R Zika virus RGN peut être sauvé avec des titres supérieurs à un million d’unités de formation de plaques par millilitre. En outre, le virus sauvé induit un effet cytopathique clair et génère des plaques homogènes d’environ deux millimètres de taille.

L’identité du virus sauvé est confirmée par l’analyse de l’immunofluorescence à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique pour la protéine E du virus Zika. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le virus Zika recombinant infectieux peut être sauvé des clones cDNA pleine longueur assemblés dans un BAC. En résumé, nous avons mis au point une puissante approche génétique inverse du virus Zika basée sur l’utilisation d’un chromosome artificiel bactérien qui pourrait être adapté pour générer les infections stables et fonctionnelles avec clone de l’ADND d’autres virus arn à brin positif afin de faciliter l’étude de la pathologie, de mettre au point un vaccin et de faciliter l’identification des médicaments ayant une activité antivirale.