Salvataggio del virus zoka ricombinante da un clone cDNA cromosoma artificiale batterico

L’obiettivo generale di questa procedura sperimentale è la generazione di virus Zika ricombinante infettivo da un clone di cDNA a figura intera, assemblato in un cromosoma artificiale batterico sotto il controllo del promotore immediato-precoce del citomegalovirus umano. Lo sviluppo di un sistema genetico inverso per virus RNA come il virus Zika consente la manipolazione diretta del genoma del virus per studiare molteplici aspetti della biologia virale e della patogenesi e sviluppare una strategia vaccinale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la costruzione del clone infettivo del virus Zika come cromosoma artificiale batterico supera la tossicità associata al genoma del flavivirus e consente il salvataggio del virus infettivo mediante trasfezione diretta del clone cDNA BAC in cellule sensibili.

Questa metodologia potrebbe essere applicata alla costruzione di cloni cDNA infettivi stabili e completamente funzionali per altri flavivirus e altri virus dell’RNA a filamento positivo. Per iniziare questa procedura, costruire il clone cDNA del virus Zika come descritto nel protocollo di testo, utilizzando siti di restrizione appropriati. Quattro frammenti di DNA che attraversano il genoma del virus Zika affiancati dal promotore umano della CMV all’estremità dei cinque primi e il ribosoma del virus del delta dell’epatite e la terminazione dell’ormone della crescita bovino e le sequenze di poliadenilazione all’estremità dei tre primi sono assemblati in un plasmide cromosomico artificiale batterico.

In primo luogo, far crescere una singola colonia di E.coli DH10B portando il clone infettivo del virus pBAC-Zika in cinque millilitri di mezzo LB contenente cloramfenicolo per otto ore a 37 gradi Celsius con tremori delicati. Quindi, aggiungere 500 millilitri del mezzo LB contenente cloramfenicolo a un pallone da due litri. Aggiungere un millilitro della coltura batterica preparata al pallone e far crescere le cellule a 37 gradi Celsius per 14-16 ore fino a quando l’OD600 è approssimativamente da 0,6 a 0,8.

Successivamente, utilizzare un kit commerciale appositamente sviluppato per la purificazione BAC per purificare il clone cDNA dell’infezione BAC per lisi alcalina seguendo le istruzioni del produttore. Un giorno prima della trasfezione, placcare le cellule di Vero nei pozzi di una piastra di sei pozza ad una densità di 500.000 cellule per pozzo nel mezzo di crescita. Per preparare la miscela di trasfezione, aggiungere quattro microgrammi del clone bac cDNA a 250 microlitri di siero ridotto medio e mescolare con attenzione.

In un tubo separato, diluire 12 microlitri di agente di trasfezione in 250 microlitri di siero medio ridotto. Vortice da mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, combinare il BAC cDNA diluito con l’agente di trasfezione.

Mescolare con cura e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante questo periodo di incubazione, utilizzare il mezzo di crescita senza antibiotici per lavare le cellule Vero e lasciare le cellule in un millilitro di mezzo fresco senza antibiotici. Quindi, distribuire i 500 microlitri della miscela cDNA e reagente di trasfezione sulle cellule Vero dropwise.

Scuotere la piastra avanti e indietro per mescolare e incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per sei ore. Dopo questo, rimuovere il mezzo di trasfezione e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita fresco con antibiotici. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, assicurandosi di controllare ogni giorno l’induzione dell’effetto citopatico.

Dopo quattro o sei giorni di trasfezione, quando il CPE è intorno al 50-75%, raccogliere i supernanti di coltura tissutale in tubi conici da 15 millilitri e centrifugare per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Quindi, raccogliere i supernatanti contenenti virus Zika ricombinante e scartare i pellet cellulari. Aliquota il supernatante in criotubi e conservali a meno 80 gradi Celsius.

Per iniziare, far crescere le cellule vero al 90% di confluenza. Lavare le cellule due volte con PBS e infettarle con il virus salvato con la molteplicità di infezione di 0,1 nel mezzo di crescita contenente il 2%FBS. Posizionare le piastre delle cellule in un’incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e roccia ogni 15 minuti per il periodo di adsorbimento di 90 minuti.

Dopo l’adsorbimento virale, rimuovere l’inoculo virale e aggiungere un mezzo di crescita fresco con 2%FBS. Incubare tre o quattro giorni alle stesse condizioni utilizzate in precedenza. Quando il CPE è di circa il 75% raccogliere la coltura tissutale supernatante e centrifuga per rimuovere i detriti cellulari.

Quindi, raccogliere il supernatante contenente il virus Zika ricombinante e scartare il pellet. Aliquota il supernatante in criotubi. Posizionare i tubi in una scatola di congelamento e conservarli a meno 80 gradi Celsius.

Quando è pronto, rimuovere un’aliquota virale dal congelatore e determinare il ttarettare virale per test della placca come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, un clone cDNA stabile e a figura intera del ceppo del virus Zika Rio Grande do Norte Natal è generato dalla clonazione sequenziale di quattro frammenti di cDNA sovrapposti nel cromosoma artificiale batterico pBeloBAC11 utilizzando metodi di clonazione convenzionali e siti di restrizione unici presenti nel genoma virale. Questo clone di cDNA a figura intera è stato affiancato all’estremità a cinque stelle dal promotore umano del citomegalovirus per consentire l’espressione dell’RNA virale nel nucleo delle cellule trasfette e all’estremità tre prime dal ribosoma del virus del delta dell’epatite seguito dalla terminazione dell’ormone della crescita bovino e dalla sequenza di poliadenilazione per produrre RNA contenenti l’estremità esatti del genoma virale.

Una volta assemblato il BAC cDNA, il virus infettivo può essere facilmente recuperato dopo la trasfezione diretta di cellule Vero sensibili con il clone bac cDNA usando liposomi cationici. Utilizzando questo approccio, R Zika virus RGN può essere salvato con formicolio superiore a un milione di unità di formatura della placca per millilitro. Inoltre, il virus salvato induce un chiaro effetto citopatico e genera placche omogenee di circa due millimetri di dimensione.

L’identità del virus salvato è confermata tramite l’analisi dell’immunofluorescenza utilizzando uno specifico anticorpo monoclonale per la proteina E del virus Zika. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il virus Zika ricombinante infettivo può essere salvato da cloni cDNA a figura intera assemblati in un BAC. In sintesi, abbiamo sviluppato un potente approccio genetico inverso del virus Zika basato sull’uso di un cromosoma artificiale batterico che potrebbe essere adattato per generare le infezioni stabili e funzionali con clone cDNA di altri virus RNA a filamento positivo per facilitare lo studio della patologia, sviluppare un vaccino e o facilitare l’identificazione del farmaco con attività antivirale.