Journal
/
/
Redning av rekombinant Zika virus fra en bakteriell kunstig kromosom cDNA Clone
JoVE Journal
Immunology and Infection
This content is Free Access.
JoVE Journal Immunology and Infection
Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

Redning av rekombinant Zika virus fra en bakteriell kunstig kromosom cDNA Clone

26,498 Views

08:10 min

June 24, 2019

DOI:

08:10 min
June 24, 2019

17 Views
, , , ,

Transcript

Automatically generated

Det overordnede målet med denne eksperimentelle prosedyren er genereringen av smittsomt rekombinant Zika-virus fra en full-lengde cDNA klone, montert i et bakteriell kunstig kromosom under kontroll av det menneskelige cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promotor. Utviklingen av omvendt genetisk system for RNA-virus som Zika-virus gjør det mulig å studere flere aspekter av virusbiologien og patogenesen og utvikle vaksinestrategi. Den største fordelen med denne teknikken er at byggingen av Zika-virusinfeksiøs klone som et bakteriell kunstig kromosom overvinner toksisiteten forbundet med flavivirusgenomet og tillater redning av smittsomt virus ved direkte transfeksjon av BAC cDNA-klonen til mottakelige celler.

Denne metodikken kan brukes til å konstruere stabile og fullt funksjonelle smittsomme cDNA-kloner for andre flavivirus samt andre positive RNA-virus. For å begynne denne prosedyren, konstruere Zika virus cDNA klone som beskrevet i tekstprotokollen, ved hjelp av passende begrensning nettsteder. Fire DNA-fragmenter som spenner over Zika-virusgenomet flankert av den menneskelige CMV-promotoren på den fem-prime enden og hepatitt delta-viruset ribosomet og bovinveksthormonterminering og polyadenyleringssekvenser i tre-prime enden er montert i en bakteriell kunstig kromosomplasmid.

Først vokser en enkelt koloni av E.coli DH10B bærer pBAC-Zika virus smittsom klone i fem milliliter lb medium som inneholder kloramfenikol i åtte timer ved 37 grader Celsius med mild risting. Deretter legger du til 500 milliliter av LB-mediet som inneholder kloramfenikol til en to-liters kolbe. Tilsett en milliliter av den tilberedte bakterielle kulturen til kolben og vokse cellene ved 37 grader Celsius i 14 til 16 timer til OD600 er ca. 0,6 til 0,8.

Etter dette, bruk et kommersielt sett spesielt utviklet for BAC rensing for å rense BAC infeksjon cDNA klone av alkalisk lysis ved å følge produsentens instruksjoner. En dag før transfection, plate Vero celler inn i brønnene av en seks-brønns plate med en tetthet på 500,000 celler per brønn i vekst medium. For å forberede transfeksjonsblandingen, tilsett fire mikrogram bac cDNA klone til 250 mikroliter serum redusert medium og bland forsiktig.

I et separat rør, fortynne 12 mikroliter transfeksjonsmiddel i 250 mikroliter serum redusert medium. Vortex å blande og inkubere ved romtemperatur i fem minutter. Deretter kombinerer du den fortynnede BAC cDNA med transinfeksjonsmiddelet.

Bland forsiktig og inkuber ved romtemperatur i 20 til 30 minutter. I løpet av denne inkubasjonsperioden, bruk vekstmedium uten antibiotika for å vaske Vero-cellene og la cellene stå i en milliliter friskt medium uten antibiotika. Deretter distribuerer du 500 mikroliter av cDNA og transfection reagensblanding på Vero-cellene dropwise.

Rock platen frem og tilbake for å blande og inkubere cellene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i seks timer. Etter dette fjerner du transfection-mediet og legger til to milliliter med frisk vekstmedium med antibiotika. Inkuber cellene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid, og sørg for å sjekke hver dag for induksjon av cytopatisk effekt.

Etter fire til seks dager med transfeksjon, når CPE er rundt 50 til 75% samle vevkultur supernatanter i 15-milliliter koniske rør og sentrifuge i 10 minutter for å fjerne cellulære rusk. Deretter høster du supernativa som inneholder rekombinant Zika-virus og kaster cellepellets. Aliquot supernatant i kryorør og lagre dem på minus 80 grader Celsius.

For å begynne, vokse Vero celler til 90% samløpet. Vask cellene to ganger med PBS og infisere dem med det reddet viruset med mangfoldet av infeksjon på 0,1 i vekstmedium som inneholder 2% FBS. Plasser platene av celler i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og stein hvert 15.

Etter viral adsorpsjon, fjerne viral inoculum og legge til frisk vekst medium med 2% FBS. Inkuber tre eller fire dager på de samme forholdene som ble brukt tidligere. Når CPE er ca 75% samle vev kultur supernatant og sentrifuge for å fjerne cellulære rusk.

Deretter høster du det overnaturlige som inneholder rekombinant Zika-virus og kaster pelleten. Aliquot den overnaturlige i cryotubes. Plasser rørene i en fryseboks og lagre dem på minus 80 grader Celsius.

Når du er klar, fjern et virus aliquot fra fryseren og bestemme viral titer av plakk analyse som beskrevet i tekstprotokollen. I denne studien genereres en stabil, full-lengde cDNA klone av Zika-virusstammen Rio Grande do Norte Natal ved sekvensielt kloning av fire overlappende cDNA-fragmenter i bakterie kunstig kromosom pBeloBAC11 ved hjelp av konvensjonelle kloningsmetoder og unike restriksjonssteder tilstede i det virale genomet. Denne full-lengde cDNA klone ble flankert på fem-prime slutten av den menneskelige cytomegalovirus arrangør for å tillate uttrykk for viral RNA i kjernen av trans infiserte celler og på tre-prime slutten av hepatitt delta virus ribosome etterfulgt av storfe veksthormon opphør og polyadenylering sekvens for å produsere RNAs som inneholder den nøyaktige tre-prime slutten av viral genom.

Når BAC cDNA er montert, kan smittsomt virus lett gjenopprettes etter direkte transfection av mottakelige Vero-celler med BAC cDNA-klone ved hjelp av kationiske liposomer. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan R Zika-virus RGN reddes med titers høyere enn en million plakkdannende enheter per milliliter. I tillegg induserer det reddet viruset en klar cytopatisk effekt og genererer homogene plakk på omtrent to millimeter i størrelse.

Den reddet virusidentiteten bekreftes via immunofluorescence-analyse ved hjelp av et bestemt monoklonalt antistoff for Zika-viruset E-proteinet. Samlet sett viser disse resultatene at smittsomt rekombinant Zika-virus kan reddes fra full lengde cDNA kloner montert i en BAC. Oppsummert har vi utviklet et kraftig Zika-virus omvendt genetisk tilnærming basert på bruk av et bakteriell kunstig kromosom som kan tilpasses for å generere stabile og funksjonelle infeksjoner med cDNA klone av andre positive RNA-virus for å lette studiet av patologien, for å utvikle en vaksine, og eller for å lette identifiseringen av stoffet med antiviral aktivitet.

Summary

Automatically generated

Den nylige epidemien av Zika virus fremhever viktigheten av å etablere omvendt genetiske tilnærminger til å utvikle vaksiner og/eller terapeutiske strategier. Her beskriver vi protokollen for å redde en smittsom rekombinant Zika virus fra en full-lengde cDNA klone samlet i en bakteriell kunstig kromosom under kontroll av den menneskelige Cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promoter.

Read Article