26,498 Views
•
08:10 min
•
June 24, 2019
DOI:
Det overordnede målet med denne eksperimentelle prosedyren er genereringen av smittsomt rekombinant Zika-virus fra en full-lengde cDNA klone, montert i et bakteriell kunstig kromosom under kontroll av det menneskelige cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promotor. Utviklingen av omvendt genetisk system for RNA-virus som Zika-virus gjør det mulig å studere flere aspekter av virusbiologien og patogenesen og utvikle vaksinestrategi. Den største fordelen med denne teknikken er at byggingen av Zika-virusinfeksiøs klone som et bakteriell kunstig kromosom overvinner toksisiteten forbundet med flavivirusgenomet og tillater redning av smittsomt virus ved direkte transfeksjon av BAC cDNA-klonen til mottakelige celler.
Denne metodikken kan brukes til å konstruere stabile og fullt funksjonelle smittsomme cDNA-kloner for andre flavivirus samt andre positive RNA-virus. For å begynne denne prosedyren, konstruere Zika virus cDNA klone som beskrevet i tekstprotokollen, ved hjelp av passende begrensning nettsteder. Fire DNA-fragmenter som spenner over Zika-virusgenomet flankert av den menneskelige CMV-promotoren på den fem-prime enden og hepatitt delta-viruset ribosomet og bovinveksthormonterminering og polyadenyleringssekvenser i tre-prime enden er montert i en bakteriell kunstig kromosomplasmid.
Først vokser en enkelt koloni av E.coli DH10B bærer pBAC-Zika virus smittsom klone i fem milliliter lb medium som inneholder kloramfenikol i åtte timer ved 37 grader Celsius med mild risting. Deretter legger du til 500 milliliter av LB-mediet som inneholder kloramfenikol til en to-liters kolbe. Tilsett en milliliter av den tilberedte bakterielle kulturen til kolben og vokse cellene ved 37 grader Celsius i 14 til 16 timer til OD600 er ca. 0,6 til 0,8.
Etter dette, bruk et kommersielt sett spesielt utviklet for BAC rensing for å rense BAC infeksjon cDNA klone av alkalisk lysis ved å følge produsentens instruksjoner. En dag før transfection, plate Vero celler inn i brønnene av en seks-brønns plate med en tetthet på 500,000 celler per brønn i vekst medium. For å forberede transfeksjonsblandingen, tilsett fire mikrogram bac cDNA klone til 250 mikroliter serum redusert medium og bland forsiktig.
I et separat rør, fortynne 12 mikroliter transfeksjonsmiddel i 250 mikroliter serum redusert medium. Vortex å blande og inkubere ved romtemperatur i fem minutter. Deretter kombinerer du den fortynnede BAC cDNA med transinfeksjonsmiddelet.
Bland forsiktig og inkuber ved romtemperatur i 20 til 30 minutter. I løpet av denne inkubasjonsperioden, bruk vekstmedium uten antibiotika for å vaske Vero-cellene og la cellene stå i en milliliter friskt medium uten antibiotika. Deretter distribuerer du 500 mikroliter av cDNA og transfection reagensblanding på Vero-cellene dropwise.
Rock platen frem og tilbake for å blande og inkubere cellene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i seks timer. Etter dette fjerner du transfection-mediet og legger til to milliliter med frisk vekstmedium med antibiotika. Inkuber cellene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid, og sørg for å sjekke hver dag for induksjon av cytopatisk effekt.
Etter fire til seks dager med transfeksjon, når CPE er rundt 50 til 75% samle vevkultur supernatanter i 15-milliliter koniske rør og sentrifuge i 10 minutter for å fjerne cellulære rusk. Deretter høster du supernativa som inneholder rekombinant Zika-virus og kaster cellepellets. Aliquot supernatant i kryorør og lagre dem på minus 80 grader Celsius.
For å begynne, vokse Vero celler til 90% samløpet. Vask cellene to ganger med PBS og infisere dem med det reddet viruset med mangfoldet av infeksjon på 0,1 i vekstmedium som inneholder 2% FBS. Plasser platene av celler i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og stein hvert 15.
Etter viral adsorpsjon, fjerne viral inoculum og legge til frisk vekst medium med 2% FBS. Inkuber tre eller fire dager på de samme forholdene som ble brukt tidligere. Når CPE er ca 75% samle vev kultur supernatant og sentrifuge for å fjerne cellulære rusk.
Deretter høster du det overnaturlige som inneholder rekombinant Zika-virus og kaster pelleten. Aliquot den overnaturlige i cryotubes. Plasser rørene i en fryseboks og lagre dem på minus 80 grader Celsius.
Når du er klar, fjern et virus aliquot fra fryseren og bestemme viral titer av plakk analyse som beskrevet i tekstprotokollen. I denne studien genereres en stabil, full-lengde cDNA klone av Zika-virusstammen Rio Grande do Norte Natal ved sekvensielt kloning av fire overlappende cDNA-fragmenter i bakterie kunstig kromosom pBeloBAC11 ved hjelp av konvensjonelle kloningsmetoder og unike restriksjonssteder tilstede i det virale genomet. Denne full-lengde cDNA klone ble flankert på fem-prime slutten av den menneskelige cytomegalovirus arrangør for å tillate uttrykk for viral RNA i kjernen av trans infiserte celler og på tre-prime slutten av hepatitt delta virus ribosome etterfulgt av storfe veksthormon opphør og polyadenylering sekvens for å produsere RNAs som inneholder den nøyaktige tre-prime slutten av viral genom.
Når BAC cDNA er montert, kan smittsomt virus lett gjenopprettes etter direkte transfection av mottakelige Vero-celler med BAC cDNA-klone ved hjelp av kationiske liposomer. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan R Zika-virus RGN reddes med titers høyere enn en million plakkdannende enheter per milliliter. I tillegg induserer det reddet viruset en klar cytopatisk effekt og genererer homogene plakk på omtrent to millimeter i størrelse.
Den reddet virusidentiteten bekreftes via immunofluorescence-analyse ved hjelp av et bestemt monoklonalt antistoff for Zika-viruset E-proteinet. Samlet sett viser disse resultatene at smittsomt rekombinant Zika-virus kan reddes fra full lengde cDNA kloner montert i en BAC. Oppsummert har vi utviklet et kraftig Zika-virus omvendt genetisk tilnærming basert på bruk av et bakteriell kunstig kromosom som kan tilpasses for å generere stabile og funksjonelle infeksjoner med cDNA klone av andre positive RNA-virus for å lette studiet av patologien, for å utvikle en vaksine, og eller for å lette identifiseringen av stoffet med antiviral aktivitet.
Den nylige epidemien av Zika virus fremhever viktigheten av å etablere omvendt genetiske tilnærminger til å utvikle vaksiner og/eller terapeutiske strategier. Her beskriver vi protokollen for å redde en smittsom rekombinant Zika virus fra en full-lengde cDNA klone samlet i en bakteriell kunstig kromosom under kontroll av den menneskelige Cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promoter.
Read Article
Cite this Article
Ávila-Pérez, G., Park, J., Nogales, A., Almazán, F., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone. J. Vis. Exp. (148), e59537, doi:10.3791/59537 (2019).
Copy