Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantificering af prolifererende humane antigen-specifikke CD4+ T-celler ved hjælp af Carboxyfluorescein Succinimidyl ester
Chapters
Summary June 4th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Præsenteret her er en protokol til måling af prolifererende CD4+ T- celler som reaktion på antigene proteiner eller peptider ved hjælp af Dye fortynding. Denne analyse er særligt følsom over for sjældne antigen-specifikke T-celler og kan modificeres for at lette kloning af antigen-specifikke celler.
Transcript
Denne protokol giver en platform til at studere CD4T-celleresponser, der ofte er svage og vanskelige at opdage. Denne teknik gør det muligt at detektionere, optælle og isolere CD4T-celler uden forudgående viden om antigenpræsentation. Den største fordel er analysen af CD4T celler, der er ganske ofte sjældne populationer forbundet med autoimmune tilstande såsom type en diabetes.
Efter at have fået den perifere blodprøve fra en sund donor fortyndes blodet i PBS i mindst et til to forhold, før derlægges 35 milliliter blod over 15 milliliter gradientmed massefylde i et 50 milliliterrør. Cellerne adskilles efter massegradientcentrifugering, og ca. 20 milliliter af det resulterende øverste plasmalag fjernes. Derefter indsamles det hvide blodlegemer lag passe på at undgå de røde blodlegemer pellet og vaske cellerne tre gange i frisk PBS.
Efter optælling fortyndes cellerne til en gange 10 til den sjette perifere mononukleare blodcelle eller PBMC pr. milliliter PBS-koncentration. Der tilsættes 300 mikroliter celler for hver kontrol i individuelle 10 milliliterrør. Efter topping hvert rør med PBS, sediment cellerne ved centrifugering og resuspenderet cellerne på en gang 10 til den sjette celler pr milliliter af RP5 medium koncentration.
Derefter plade 100 mikroliter af celler pr kontrol til hver af tre brønde af en 96 godt plade, der indeholder 100 mikroliter af RP5 medium per brønd. Anbring pladen i cellekulturskuvøsen i syv dage. Dernæst overføres de resterende PBPC'er til et nyt 50 milliliterrør, og der tilsættes en mikroliter CFSE-arbejdslageropløsning pr. milliliter celleaffjedring til siden af røret.
Hurtigt vende røret flere gange for at blande og placere cellerne i en celle kultur inkubator i fem minutter. Ved inkubationens afslutning standses reaktionen med fem milliliter RP5-medium, og cellerne opsamres ved centrifugering. Pelletspend på én gang 10 gange til det sjette PBM'er pr. milliliter frisk RP5-medium og tilsættes en milliliter celler til et 10 milliliterrør pr. antigen, der skal testes.
Derefter tilsættes 100 mikroliter celler pr. antigen til hver af tre brønde af en 96 brøndplade, der indeholder 100 mikroliter RP5-medium suppleret med det fortyndede antigen af interesse pr. brønd. Anbring pladen i cellekulturskuvøsen i syv dage. For at plette CD4+T-cellepopulationerne til flowcytometrisk analyse overfører hele cellerne i slutningen af kulturen fra hver brønd til individuel fluorescensaktiveret cellesortering eller FACS-rør.
Hver prøve vaskes med en milliliter PBS suppleret med 0,1 % føtal kalveserum eller FCS. Opslæm pellets i et passende anti-humant CD4 antistof i 100 mikroliter PBS plus FCS pr. rør. Inkuber cellerne ved fire grader Celsius i 20 minutter beskyttet mod lys.
Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne i en milliliter frisk PBS plus FCS pr. rør, og pelletsene opsbruges igen i 100 mikroliter frisk PBS plus FCS. Umiddelbart før analysen tilsættes en mikroliter propidium iodid til hvert rør for at tillade udelukkelse af døde celler. Gate lymfocytter i henhold til deres frem og side scatter områder.
For at udelukke de apoptotiske celler skal du gate det fremadrettede scatter-område versus propidiumididætte negative celler og bruge de uhæmmede celler til at indstille en spændings baseline for de ikke-fluorescerende celler. Indstil spændingerne for CD4-antistoffluorophore og CFSE-signalet, så fluorescerende signalet er under 1000 for hver. Brug enkelt farvekontrol CFSE- og CD4-prøverne til at bekræfte et positivt fluorescerende signal for hver farve ved hjælp af de spændinger, der er indstillet med de uhæmmede celler.
Da CFSE og propidiumidodid har en vis spektrale overlapning, justeres kompensationen for at trække propidiumidodidfluorescensen fra CFSE-fluorescensen, indtil CFSE-eneste prøve ikke giver et signal i propidiumdodidkanalen. Når alle prøverne er blevet analyseret, beregnes cellefordelingsindekset ved at dividere antallet af opdelte celler med 5000 udelte celler fra antigenet stimuleret gruppe med det gennemsnitlige antal opdelte celler pr. 5000 udelte celler fra cellerne dyrket uden antigen. Næsten alle donorer demonstrere en stærk T-celle reaktion på Stivkrampe toksoid efter in vitro stimulation, fordi donorerne er blevet vaccineret gør Tetanus toksoid en nyttig positiv kontrol antigen.
Udbredelsen af CD4+T-celler fra ustimulerede PBPC'er er dog minimal. Efter syv dages stimulation med humant pro-insulin C-peptid kan der påvises pro-insulin C-peptid specifikke CD4+T-celler i det perifere blod hos en person med type 1-diabetes. PBMC stimuleret med influenza A virus matrix protein demonstrerer også spredning.
Tilsammen viser disse data, at analysen kan udføres ved hjælp af proteiner i fuld længde samt korte syntetiske peptider. FACS-komponenten i denne metode kan udføres ved hjælp af et cellesorteringsstrømscytometer. Ved hjælp af en cellesortering kan de antigenspecifikke T-celler isoleres på det enkelte celleniveau til downstream-analyse.
Denne metode har gjort det muligt for opdagelsen af CD4T celle reaktioner hos personer med tidlig debut type en diabetes. Analyse af disse sjældne T-celle populationer udnytte andre metoder præsenterer forskellige tekniske udfordringer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
