Biology
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Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares
Chapters
Summary June 3rd, 2019
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O protocolo descreve o uso de miografia de arame para avaliar a tensão isométrica transmural de artérias mesentéricas isoladas de camundongos, com especial consideração da modulação por fatores liberados das células endoteliais e dos tecidos adiposos perivasculares.
Transcript
Protocolo muito rigoroso é necessário para que possamos comparar validamente os preparativos dos mesmos animais ou de diferentes animais ou artérias na presença ou ausência da gordura que os cerca ou na presença ou ausência do endotélio. A principal vantagem desta técnica experimental é que podemos comparar anéis da mesma artéria sob condição isométrica e, assim, validamente tirar conclusões sobre o impacto dos fatores experimentais que investigamos. Este protocolo fornece insights sobre a modulação da responsividade vascular por tecidos adiposos perivasculares de diferentes animais geneticamente modificados.
Disfunções teciduais adiposas representam um fator de risco independente para a hipertensão arterial e suas complicações cardiovasculares associadas. Nosso miógrafo envolve múltiplas etapas complicadas que requerem extrema cautela em cada ponto para evitar danificar o vaso, especialmente durante a montagem, e para garantir que a nave responda adequadamente a vários estímulos. Inicie este procedimento com preparações e dissecção dos anéis arteriais mesenéricos descritos no protocolo de texto.
Ligue o computador e abra o software de gravação de dados. Salve o experimento como um arquivo de dados de gráfico de laboratório com um novo nome para evitar substituir o arquivo de configuração original. Abra a janela de configurações de normalização e ajuste o fator K para um.
Aceite os valores padrão para calibração de IPs, pressão de destino, tempo médio on-line e tempo de atraso. Clique bem para salvar as configurações. Selecione canais de interesse e insira o diâmetro do fio, os pontos finais do tecido e a leitura inicial do micrômetro na janela de normalização.
Para iniciar o procedimento de normalização, aplique o primeiro estiramento passivo no vaso sanguíneo girando o parafuso do micrometro no sentido anti-horário. Depois de esperar três minutos para que a embarcação se estabilize, insira a nova leitura de micrômetro na janela de normalização. A tensão da parede é calculada automaticamente e mostrada como um ponto no gráfico.
Após cada estiramento passivo, substitua o tampão de krebs de controle por um krebs de potássio alto iso-osmótico contendo 150 mililitros de potássio. Quando a contração atingir um platô em cerca de três minutos, registre a força ativa subtraindo a força passiva em cada trecho da força ativada do potássio. Calcule a tensão da parede, bem como os valores de circunferência interna.
Remova a condição de potássio alto substituindo o tampão de potássio alto por um tampão de krebs fresco. Repita a lavagem por três vezes ao longo de cinco minutos. Repita as etapas de normalização induzindo trechos passivos seguidos de contração ativa em curvas alternativas até que a tensão ativa comece a diminuir.
Lave bem o tampão de krebs de potássio alto e equilibre os preparos por mais 30 a 45 minutos. Redefinir as tensões basais a zero para que apenas as respostas ativas contratuais sejam registradas durante o experimento subsequente. Prepare e monte anéis arteriais emparelhados conforme descrito no protocolo de texto das seções adjacentes de cada artéria.
Prepare um anel arterial com PVAT intacto e o outro com PVAT removido. Após a normalização, pré-contrate os segmentos arteriais com tampão de krebs de potássio alto adicionando 115 milialares de cloreto de potássio à câmara contendo krebs. Após a contração ao período do planalto, lave o potássio alto e substitua o tampão por um tampão de krebs aerado fresco.
Repita a lavagem três vezes ao longo de cinco minutos. Repita a estimulação do cloreto de potássio e a lavagem três vezes e registre a resposta contracil máxima ao cloreto de potássio subtraindo a tensão da linha de base da tensão devido à estimulação do cloreto de potássio. Após a última contração e lavagem, reabasteca a câmara com tampão de krebs morno e aerado e deixe a artéria se recuperar por cerca de 30 minutos antes de realizar a próxima tarefa.
A cada câmara, adicione quantidades cumulativas de fenilefrina para induzir os aumentos dependentes da concentração e a tensão isométrica das preparações quiescentes. Depois de adicionar a última dose de agonista, lave a droga completamente e reabasteça a câmara com tampão de krebs fresco. Plote as respostas dependentes da concentração como percentuais crescentes das contrações máximas induzidas pelo cloreto de potássio.
Para avaliar a contribuição do óxido nítrico, incubar as preparações com o inibidor de sinthase de óxido nítrico L-NAME por 30 minutos antes da adição de fenilefrina. Para realizar uma segunda curva de resposta de concentração sequencialmente, lave a câmara completamente e repetidamente para remover todos os agonistas anteriores até que não sejam observadas mais alterações de tom. A normalização da relação comprimento-tensão foi realizada para artérias mesentéricas isoladas de modelos de camundongos alimentados com chow padrão ou uma dieta rica em gordura.
Uma relação passivo de comprimento-tensão foi estabelecida pelo alongamento incremental dos segmentos da artéria até que uma circunferência interna correspondente a 100 milímetros de pressão transmural de mercúrio, ou IC100, foi obtida. Após cada trecho, 115 cloreto de potássio milimila foram aplicados para estimular contrações. As curvas de tensão de comprimento ativo foram traçadas a partir dos dados de força ativa no eixo Y e dos valores calculados de IC a partir dos dados do micrometro no eixo X.
Um valor ic situado dentro do planalto máximo é IC1. O fator de normalização, K, foi calculado como a razão de IC1 e IC100, que poderia então ser aplicada a amostras do mesmo tipo de vaso no experimento subsequente. Aqui são mostradas gravações de saída das respostas vasoconstritores à fenilefrina em artérias mesentéricas com ou sem PVAT circundante.
Concentrações cumulativas de fenilefrina foram aplicadas para estimular as contrações de artérias mesentéricas coletadas de um camundongo de 16 semanas. As respostas contratuais foram registradas e calculadas como uma porcentagem de 150 milimônios cloreto de potássio induzido contração máxima. A área sob as curvas de contração foi traçada para comparação.
Note que pvat de adipose um camundongo provocou um efeito anticontile na resposta à fenilefrina. Ao obter contrações induzidas pelo KCL, as respostas devem ser estáveis e estáveis. Se a resposta ainda estiver aumentando após três administrações incrementais de KCL, a estimulação kcl pode ser necessária.
Para alcançar as condições ideais das tensões, o passo de normalização é muito importante, pois determina a força para abrir os vasos sanguíneos. Se não for feito corretamente, afetará todo o experimento. Este protocolo pode ser aplicado a outras configurações, além de contração ou relaxamento induzido por fenilefrina.
Por exemplo, na presença ou ausência de tecido adiposo perivascular, nervos autônomos ou endotélio. Com este protocolo, os pesquisadores podem examinar pequenos vasos sanguíneos de modelos animais doentes em diferentes condições fisiopatológicas, como obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares.
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