Neuroscience
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Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析
Chapters
Summary June 7th, 2019
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我々は、新生ラット脳組織を処理して、神経終末におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析のための高分解能電子顕微鏡写真を得るための手順を説明する。これらの方法で得られた顕微鏡写真は、多数の他の細胞成分およびそれらの寸法構造関係の形態を研究するためにも使用することができる。
Transcript
透過型電子顕微鏡のための組織調製のためのいくつかの既存のプロトコルの中で、シナプス前末端でシナプス小胞分布の形態測定分析を行うために最適な構造保存と高解像度顕微鏡を得る方法を選択しました。これらの方法で得られた高コントラスト画像は、シナプス前膜にドッキングされた小胞のシナプス前膜数と小胞間距離からのシナプス小胞の距離などのパラメータを定量化することを可能にする。これらのパラメータはすべてシナプス機能を示しています。
シナプス小胞の空間組織における変化はシナプス機能の破壊に関連している可能性があるため、これらの方法はシナプス開発に対する全身麻酔薬の影響を調べるために使用されてきた。これらの方法は、シナプスの詳細な形態に対する薬物または治療の効果を調べ、その機能に関する洞察を提供するためにも使用できる。血管灌流を介してパラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドで以前に固定されたラット脳切片の後の固定のためのオスミウム四酸化症を準備することで始めます.
四酸化オスミウムで処理した後、セクションが硬くなります。したがって、組織の取り扱いはそれ以来注意を必要とします。また、オスミウムを追加する前に、任意の折り畳みが組織骨折をもたらす可能性が高いように、あなたのセクションが平らにされていることを確認してください。
4%オスミウム四酸化窒素と水の1つの5ミリリットルガラスアンプルを開き、茶色のガラス瓶の中に落とします。0.2モルリン酸緩衝液の5ミリリットルを加え、0.1モルリン酸緩衝液の追加10ミリリットルを加えて、1%の最終溶液を達成する。長い針を取り付けた20ミリリットルのシリンジを使用して1%オスミウム四酸化を引き上げ、オスミウム四酸化オスミウムをアルミ箔で覆われた茶色のガラス瓶に加えます。
標本が展開され、平らにされていることを確認した後、標本バイアルに1%オスミウム四酸化および0.1モルPBを加える。試料をオスミウム四酸化スに室温で1時間インキュベートする。インキュベーションが終了した後にマイクロピペットで四酸化オスミウムを抽出し、プロトコルに記載されているようにセクションをすすいでください。
酢酸ウラニルを調製するには、攪拌板に100ミリリットルの70%エタノールを含む200ミリリットルの体積ガラスフラスコを置きます。フラスコに酢酸ウラニルの4グラムを追加し、光による沈殿を防ぐためにアルミニウム箔を包み、連続的に攪拌します。50%エタノールでセクションを脱水します。
4%の酢酸を1時間調製した染色し、原稿に記載されているように連続脱水およびすすいで続ける。60ミリリットルのギャージ注射器から注射器プランジャーを取り出し、安全針でキャップします。開いた側を上にしてシリンジを置き、樹脂ミックスの各成分を1つずつ加えます。
525マイクロリットルのDMP30をピペットで追加して仕上げ。DMPが非常に粘性であるように非常にゆっくりとピペットのプランジャーを移動します。プランジャーを注射器に戻します。
シリンジを数回反転して内容を混ぜます。色は黄色から琥珀色に変わります。注射器の中の空気を避難させる。
その後、少なくとも30分間連続的に揺れるロッカーの上に置きます。1ボリュームのエポキシ樹脂と1ボリュームのアセトンをシンチレーションバイアルに加え、振って混ぜます。アセトンの蒸発を避けるために、最後のアセトンリンスを覆った後、組織セクション上のアセトン混合物に1つの樹脂にこれを適用します。
2~4時間後に樹脂とアセトンの混合物を1対1で取り出し、フルレジンに交換し、4時間インキュベートします。すべての樹脂廃棄物をボンネットの下の回収容器に入れて重合し、後で処分する。透明なポリクロロトリフルオロエチレンフィルムを2枚切り、70%エタノールで拭きます。
セクションの各側面に少なくとも1.5センチメートルのティッシュフリープラスチックが存在するようにトリミングし、同じ幅を持っていますが、上のシートの高さは底面の約2/3であることを確認します。ゆっくりとバイアルを傾け、細かいラクダの絵筆と柔軟なマイクロヘラを使用して、標本を底から非常に穏やかに持ち上げます。その後、慎重にバイアル壁に沿ってセクションを移動し、下部PCTFEシートに転送します。
余分な樹脂をマイクロヘラで取り除き、上のシートで標本をそっと覆います。組織部分に直接圧力をかけずに閉じ込められた気泡を静かに押し出し、余分な樹脂を拭き取ります。溶剤耐性ペンを使用してシートにラベルを付け、オーブンに2〜3日間摂氏60度で置き、重合します。
サンドイッチされたPCTFEシートをそっと引き離して開きます。溶剤耐性ペンを使用して、組織の近くに付着したシートの側面をマークします。ディスクパンチを使用して、ペンマークがパンチアウト組織の一部であることを確認するセクションの円サンプルを取得します。
試料に光が光を当てたとき、ペンマークが輝きます。埋め込みカプセル側のキャップをカプセルホルダーの上に置きます。キャップに樹脂を一滴置き、パンチドディスクをキャップの内側に挿入し、組織セクションを上に向けます。
穏やかなコルクスクリューの動きを使用してキャップにカプセルを挿入します。細かいピンセットを使用して、印刷された長さ2センチメートルの紙のラベルをカプセルに転がし、カプセルの側壁の湾曲に収まることを確認します。カプセルの中に埋め込み樹脂を注ぎ、カプセルの端まで満たし、尖った木製の棒を使用して組織標本を底に押し下げます。
カプセルをオーブンに60°Cで2~3日間置き、重合します。そして、プロトコルに記載されているように、切り分けと染色を続行します。神経細胞構造の十分な保存の電子顕微鏡写真は、破断のない層状細胞膜を示す。
細胞質は最終的に粒状で、空のスペースはありません。ミトコンドリアは、保存された外側の二重膜と無傷の内部クリステで腫れたり縮めたりしていません。シナプス小胞を可視化し、シナプス前膜からの距離を測定するためには、神経の超構造と微細な形態学的詳細の最適な保存が不可欠です。
シナプス小胞は、切れ目のない単一の膜によって明確かつ並べられるべきです。シナプス小胞分布の形態測定解析を容易にするためには、シナプス前膜と心内膜は、その連続性に平行に保存されるべきである。組織構造の欠陥保存の電子顕微鏡写真は、神経細胞膜の歪みや破損、および著しく拡大した細胞外空間の存在を示す。
ミトコンドリアは膨張し、クリステが腫れているように見える。欠陥組織構造保存の別の例では、細胞外空間が拡大した細かい粒状の細胞質物質の代わりに、細胞質内に大きな白い空きスペースがあった。全体として人工膜はグルタルアルデヒドとの固定中に脂質の動員に起因する可能性が高い。
若い脳組織を働くとき、新生児ラットの脳の中にできるだけ近い間にトニシティを保ち、関節の実際の組織の収縮および腫れを最小限に抑えるように、すべての溶液のための溶媒として1モルリン酸塩緩衝液を使用する。これらの方法で得られた顕微鏡写真は、シナプス小胞以外の多くの細胞成分の詳細な形態および次元構造関係を研究するために使用することができる。例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置および核クロマチンが挙げられる。
このプロトコルのいくつかのステップは、有毒である可能性のある化学物質を必要とします。常にヒュームフードの下で動作し、アルデヒド、オスミウム、ウラン、鉛化合物を扱うときは、個人的な保護具を着用してください。
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