Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Forberedelse af nyfødte rotte hjernevæv til Ultrastrukturel morfometrisk analyse af Synaptic Vesicle distribution på nerve terminaler
Chapters
Summary June 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver procedurer for behandling af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå højopløsnings elektron mikrografer til morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling ved nerve terminaler. Mikrograferne opnået med disse metoder kan også bruges til at studere morfologien af en række andre cellulære komponenter og deres dimensionale strukturelle relationer.
Transcript
Blandt flere eksisterende protokoller for vævspræparation til transmission elektronmikroskopi valgte vi metoder, der giver optimal strukturel konservering og højopløsningsmikrografier til at udføre morfometrisk analyse af synaptiske vesiklerfordeling ved præsynaptiske terminaler. De billeder med stor kontrast, der er fremkommet ved disse metoder, gør det muligt at kvantificere parametre såsom afstand af synaptiske vesikler fra det præsynaptiske membranantællertal af vesikler, der er forankret ved den præsynaptiske membran og inter vesicle afstande. Alle disse parametre er tegn på synaptisk funktion.
Da ændringer i den geografiske organisering af synaptiske vesikler kan være forbundet med afbrydelse af synaptisk funktion, er disse metoder blevet anvendt til at undersøge virkningerne af generel bedøvelse på synaptisk udvikling. Disse metoder kan også bruges til at undersøge virkningerne af ethvert lægemiddel eller behandling på den detaljerede morfologi af synapser at give indsigt i deres funktion. Begynd med at forberede osmium tetroxid til post fiksering af rotte hjerne sektioner tidligere fastsat med paraformaldehyd og glutaraldehyd via vaskulær perfusion.
Sektioner bliver stive efter behandling med osmium tetroxid. Derfor væv håndtering kræver opmærksomhed fra da af. Også, før du tilføjer osmium, Sørg for, at dine sektioner er fladtrykt som enhver fold vil sandsynligvis resultere i væv fraktur.
Åbn en fem milliliter glas ampule på 4%osmium tetroxid og vand og slip det inde i en brun glasflaske. Der tilsættes fem milliliter 0,2 molarphosphatbuffer, og der tilsættes derefter yderligere 10 milliliter 0,1 molarphosphatbuffer for at opnå en 1%endelig opløsning. Brug en 20 milliliter sprøjte udstyret med en lang nål til at udarbejde 1% osmium tetroxid og derefter tilføje osmium tetroxid til en brun glaskrukke dækket med aluminiumsfolie.
Efter at have sørget for, at prøven er blevet udfoldet og fladtrykt, tilsættes 1%osmium tetroxid og 0,1 molar PB til prøvehætteglasset. Prøven inkuberes i osmiumtetroxid i en time ved stuetemperatur. Osmiumtetroxid udvindes med et mikropipet, når inkubationen er færdig, og skyl sektionerne som beskrevet i protokollen.
For at forberede uranylacetat anbringes en 200 milliliterkolbe med 100 milliliter 70% ethanol på en omrøringsplade. Tilsæt fire gram uranylacetat til kolben, pak en aluminiumsfolie ind for at forhindre udfældning af lys og rør kontinuerligt. Dehydrer sektionerne i 50% ethanol.
Plet med forberedt 4% uranylacetat i en time og følg med serielle dehydrering og skylning som beskrevet i manuskriptet. Fjern sprøjtestemplet fra en 60 milliliterslydsprøjtesprøjte, og hætten med en sikkerhedsnål. Ansvar sprøjten med den åbne side op, og tilsæt hver ingrediens i harpiksen en efter en.
Afslut ved at tilføje 525 mikroliter DMP30 med en pipet. Flytning af stemplet af pipet meget langsomt som DMP er meget tyktflydende. Sæt stemplet tilbage i sprøjten.
Inverter sprøjten et par gange for at blande indholdet. Farven skifter fra gul til gul. Evakuer luften inde i sprøjten.
Derefter placere den på en rocker med kontinuerlig omrystning i mindst 30 minutter. Tilsæt en volumen epoxy harpiks og en volumen af acetone til en scintillation hætteglas og ryst til at blande. Påfør denne ene til en harpiks til acetone blanding på vævssektionen efter den sidste acetone skylning holde i dækket for at undgå acetone fordampning.
Fjern den ene til en blanding af harpiks og acetone efter to til fire timer og erstatte det med fuld harpiks og inkubere i fire timer. Læg alt harpiksaffald i en opsamlingsbeholder under kølerhjelmen for at polymerisere og bortskaffes senere. Skær to rektangulære stykker klar polychlortrifluorethylen film og tør dem med 70% ethanol.
Trim dem, så der er mindst 1,5 centimeter vævsfri plast på hver side af sektionen, og sørg for, at de har samme bredde, men højden af arket på toppen er ca 2/3 af det nederste ark. Vip langsomt hætteglasset og brug en fin kamel pensel og en fleksibel mikrospatel til meget forsigtigt at løfte prøven fra bunden. Flyt derefter forsigtigt sektionen langs hætteglasvæggene og overfør den til det nederste PCTFE-ark.
Fjern overskydende harpiks med en mikrospatel, og dæk forsigtigt prøven med det øverste ark. Skub forsigtigt eventuelle fanget luftbobler ud uden at trykke direkte på vævssektionen og udslette den overskydende harpiks. Brug en opløsningsmiddelresistent pen til at mærke arkene og placere i en ovn ved 60 grader celsius i to til tre dage for at polymerisere.
Træk forsigtigt de klemt PCTFE-ark fra hinanden for at åbne dem. Brug en opløsningsmiddelresistent pen til at markere den side af arket, der indeholder den klæbende sektion, der markerer den i nærheden af vævet. Brug en skivepunch til at få en cirkelprøve af sektionen, og sørg for, at pennemærket er en del af det udstansede væv.
Pennemærket glimter, når lyset lyser på prøven. Anstænft hætten på en indlejringskapselside op på en kapselholder. Placer en dråbe harpiks på hætten og indsæt den udstansede disk inde i hætten med vævssektionen opad.
Sæt en kapsel i hætten ved hjælp af en blid proptrækkerbevægelse. Brug fine pincet til at rulle og sænke en trykt to centimeter langt stykke papir etiket i kapslen, og sørg for det passer til krumning af sidevæggene i kapslen. Hæld indlejring harpiks inde i kapslen, fyld op til kanten af kapslen og bruge en spids træpind til at skubbe vævsprøven ned til bunden.
Anse kapslen i ovnen ved 60 grader celsius i to til tre dage for polymerisering. Og fortsæt derefter med trækning og farvning som beskrevet i protokollen. Elektron mikrograf af tilfredsstillende bevarelse af neuronal cellestruktur viser lagdelte cellemembraner uden pauser.
Cytoplasmaet er endelig granuleret og uden tomme mellemrum. Mitokondrier er hverken hævede eller indskrumpet med en bevaret ydre dobbelt membran og intakt indre cristae. Optimal konservering af neuronal ultrastruktur og fine morfologiske detaljer er afgørende for at visualisere synaptiske vesikler og måle deres afstand fra den præsynaptiske membran.
Synaptiske vesikler skal være forskellige og foret med en ubrudt enkelt membran. For at lette morfometrisk analyse af fordeling af synaptisk vesicle bør præsynaptiske og postsynaptiske membraner være parallelle i deres kontinuitet bevares. Elektron mikrograf af defekt konservering af vævsstruktur viser forvrængning og brud af neuronal cellemembraner og tilstedeværelsen af markant forstørrede ekstracellulære rum.
Mitokondrier synes udspilet og har hævede cristae. I et andet eksempel på defekt vævsstruktur konservering, var der store hvide tomme rum i cytoplasmaet i stedet for fint granulære cytoplasmatisk stof med forstørrede ekstracellulære rum. En kunstig membran som forall sandsynligvis skyldes mobilisering af lipider under fiksering med glutaraldehyd.
Når du arbejder unge hjernevæv bruge 1 molar fosfat buffer som et opløsningsmiddel til alle dine opløsning, så du holder tonicity så tæt som muligt på den nyfødte rotte hjerne og minimere artefaktuel væv svind og eller hævelse. De mikrografer, der opnås med disse metoder, kan bruges til at studere de detaljerede morfologi og dimensionelle strukturelle relationer af en række andre cellekomponenter end synaptiske vesikler. For eksempel mitokondrier, golgi apparater og nukleare kromatin.
Flere trin i denne protokol kræver kemikalier, der kan være giftige. Arbejd altid under en røghætte og bær personlige værnemidler ved håndtering af aldehyder, osmium, uran og blyforbindelser.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
