Neuroscience
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新生大鼠脑组织在神经端子突形圆锥花序分布超微结构形态分析中的制备
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Summary June 7th, 2019
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我们描述了处理新生大鼠脑组织以获得高分辨率的电子显微镜的程序, 以进行神经末端突触囊分布的形态分析。用这些方法获得的显微图像也可用于研究许多其他细胞成分的形态及其尺寸结构关系。
Transcript
在用于传输电子显微镜组织准备的几种现有方案中，我们选择了产生最佳结构保存和高分辨率显微图的方法，对突触囊泡在预突触终端分布进行形态分析。通过这些方法获得的高对比度图像允许量化参数，如突触囊泡距离与预突触膜数量的囊泡停靠在预突触膜和囊泡间距离。所有这些参数都指示突触功能。
由于突触囊泡的空间组织的变化可能与突触功能的破坏有关，这些方法已用于检查一般麻醉剂对突触发育的影响。这些方法还可用于检查任何药物或治疗对突触的详细形态的影响，以提供洞察其功能。首先准备三氧化二氮的骨质，用于通过血管灌注修复以前用甲状甲醛和谷胱甘肽固定的大鼠脑部分的固定后。
使用三氧化硅治疗后，部分变得刚性。因此，组织处理需要关注从那时起。此外，在添加 osmium 之前，请确保您的部分被平展，因为任何褶皱都可能导致组织骨折。
打开一个五毫升的玻璃安培4%的三氧化硅和水，并滴在棕色玻璃瓶中。加入5毫升0.2摩尔磷酸盐缓冲液，然后再添加10毫升0.1摩尔磷酸盐缓冲液，实现1%的最终溶液。使用装有长针的 20 毫升注射器，将 1%的三氧化二氮抽出，然后将三氧化二氮加入用铝箔覆盖的棕色玻璃罐中。
在确保试样已展开并扁平化后，在试样小瓶中加入 1%的三氧化钛和 0.1 摩尔 PB。在室温下将样品孵育为三氧化硅一小时。孵育完成后，用微管提取三氧化硅，并如协议所述冲洗部分。
要准备醋酸兰醇，请将含有100毫升70%乙醇的200毫升体积玻璃瓶放在搅拌板上。在烧瓶中加入四克醋酸兰基，包裹铝箔，防止光线沉淀，并持续搅拌。在50%乙醇中脱水部分。
用准备好的4%醋酸碱染色一小时，然后按照手稿中所述连续脱水和冲洗。从 60 毫升盖夫奇注射器中取出注射器柱塞，用安全针盖住它。将注射器与开放侧向上放置，并一个地添加树脂混合物的每个成分。
通过添加 525 微升 DMP30 与移液器完成。由于 DMP 非常粘稠，因此移液管的柱塞移动非常缓慢。将柱塞放回注射器中。
反转注射器几次以混合内容物。颜色将从黄色更改为琥珀色。疏散注射器内的空气。
然后放在摇杆上，持续摇晃至少 30 分钟。将一卷环氧树脂和一卷丙酮加入闪烁小瓶中，然后摇动混合。将这一树脂涂抹在组织部分的丙酮混合物上，最后一次丙酮冲洗后，保持覆盖，以避免丙酮蒸发。
两到四个小时后，将树脂和丙酮的混合物取出，用全树脂代替，孵育四小时。将所有树脂废物放入收集容器中，进行聚合，并在以后处理。切两块透明聚氯氟乙烯薄膜的矩形片，然后用70%乙醇擦拭。
修剪它们，使部分的每一侧至少有 1.5 厘米的无组织塑料，确保它们具有相同的宽度，但顶部的纸张高度大约是底片的 2/3。慢慢倾斜小瓶，使用细骆驼画笔和灵活的微铲非常轻轻地从底部抬起标本。然后小心地沿小瓶壁移动该部分，并转移到底部 PCTFE 纸张上。
用微铲去除多余的树脂，用顶片轻轻盖住试样。轻轻推出任何被困的气泡，无需将直接压力施加到组织部分，并清除多余的树脂。使用耐溶剂笔为板材贴上标签，并在 60 摄氏度的烤箱中放置两到三天进行聚合。
轻轻拉开夹心的 PCTFE 纸张以打开它们。使用耐溶剂笔标记板材的侧面，该侧面包含标记组织附近的粘附部分。使用圆盘冲孔获取部分的圆样，确保笔标记是冲孔组织中的一部分。
当光在标本上闪耀时，笔标会闪闪发光。将嵌入胶囊的盖侧放在胶囊支架上。将一滴树脂放在盖子上，并将冲孔盘插入盖内，组织部分朝上。
使用柔和的螺丝钉运动将胶囊插入盖子。使用精细的钳子将打印的两厘米长的纸标签卷入胶囊中，确保它符合胶囊侧壁的曲率。将嵌入树脂倒入胶囊内，填充到胶囊边缘，并使用尖木棒将组织标本向下推至底部。
将胶囊在60摄氏度的烤箱中放入两到三天进行聚合。然后继续像协议中描述的那样进行分节和染色。神经细胞结构的令人满意的保存的电子显微图显示分层细胞膜没有断裂。
细胞质是最终粒度，没有空白。线粒体既不肿胀也不收缩与保守的外双膜和完整的内部克里斯塔。神经元超结构和精细形态细节的最佳保存对于可视化突触囊泡并测量它们与预突触膜的距离至关重要。
突触囊泡应不同，由不间断的单膜衬里。为了便于对突触囊泡分布进行形态分析，前突触膜和后突触膜的连续性应平行于其保持。组织结构缺陷保存的电子显微图显示神经元细胞膜的变形和破损，以及明显扩大的细胞外空间的存在。
线粒体出现扩张，有肿胀的克里斯塔。在另一个有缺陷的组织结构保存的例子中，细胞质内有较大的白色空白空间，代替细粒度细胞质物质，并扩大细胞外空间。一种人造膜，很可能是由于在谷胱甘肽固定过程中调动脂质造成的。
当工作年轻的脑组织使用1摩尔磷酸盐缓冲液作为溶剂，你所有的解决方案，使保持补品尽可能接近新生大鼠大脑，并尽量减少人工组织收缩和或肿胀。通过这些方法获得的显微图可用于研究突触囊泡以外的许多细胞成分的详细形态和维度结构关系。例如，线粒体、高尔吉仪器和核染色质。
该协议中的几个步骤要求化学品具有毒性。处理醛、铀、铀和铅化合物时，始终在烟罩下工作并穿戴个人防护装备。
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