Summary
我々は、新生ラット脳組織を処理して、神経終末におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析のための高分解能電子顕微鏡写真を得るための手順を説明する。これらの方法で得られた顕微鏡写真は、多数の他の細胞成分およびそれらの寸法構造関係の形態を研究するためにも使用することができる。
Abstract
私たちの研究室や他の多くは、シナプス小胞の形態と空間的組織化を研究するために、透過型電子顕微鏡検査の高い分解力を利用しています。シナプス前小胞分布の定量分析に必要な形態学的詳細の程度を得られる高品質の電子顕微鏡写真を得るためには、最適な試料調製が重要である。化学的固定は、試料調製のプロセスの第一歩であり、微細な ultrastructure を維持するために最も重要です。グルタルアルデヒド溶液を用いた血管固定、続いて四酸化オスミウムを用いたビブラトーム切片標本の治療により、分子の最大数、特にタンパク質と脂質を安定化し、優れた保存をもたらすの ultrastructure。その後、組織は、切片、シーケンシャル脱水および樹脂包埋で処理されます。酢酸ウラニル (すなわち、樹脂埋め込み前のビブラトームによる組織の染色) による En ブロック染色は、内因性のコントラストを高め、検体処理中の抽出に対して細胞成分を安定化させます。コントラストは、超薄断面の後染色として酢酸ウラニルを適用することによってさらに増加させることができる。酢酸ウラニル処理後のクエン酸鉛を用いた極薄の切片の二重染色により、ウラニルへの鉛の選択的結合による核酸含有構造の電子不透過性を強化することにより、画像分解能も向上させる。透過型電子顕微鏡法は、シナプスベシクルの形態学的詳細の特徴付けと、末端 bouton におけるそれらのサイズおよび空間的組織の定量化のための強力なツールである。しかし、固定された組織を使用しているため、透過型電子顕微鏡は、生きているプロセスや進化する過程に関する間接情報しか提供できません。したがって、主な目的は、シナプスの小胞の人身売買およびエキソサイトーシスの動的または機能的側面を研究することである場合、他の技術を考慮する必要があります。
Introduction
我々は、新生ラット脳組織の調製方法について、神経ターミナル1、2におけるシナプス小胞空間分布の詳細な morphometric 分析のための高品質の電子顕微鏡写真を得るために記述する。これらの方法に従って検体を処理することによって得ることができるハイコントラスト顕微鏡写真は、多数の細胞成分およびそれらの寸法構造関係3,4の詳細な形態を研究するためにも使用することができる。
透過型電子顕微鏡 (TEM) は、オルガネラや他の細胞構造の形態を定量的に研究する強力なツールです。この十年のように、高圧凍結による cryofixation を除いて、免疫タグ付けなしで脂質膜およびオルガネラの同じ程度の分解能を提供できる他の調査方法はない。しかし、凍結置換技術は広く使用されておらず、通常は高価な装置と長い準備時間を必要とします。
TEM の高い分解力を活かすためには、最適な試料調製が最も重要です。検体調製の主な目的は、生体状態からの変化を最小限に抑えて組織構造を保存し、検体のコントラストを高め、処理中の細胞成分の抽出や電子への曝露に対する組織の安定化を図ることである。ビーム。TEM のティッシュの準備のための多数の議定書は長年にわたっていくつかの実験室によって導入され、完成した。それらの多くは、シナプス小胞5、6、7、8、9、10、11の最適な可視化のための方法に焦点を当てています。現在使用されている多くの確立された、金の標準的な方法の中で、私達は最適のティッシュの構造を維持することを目指す化学固定、ポスト固定、en ブロックの染色、連続的な脱水、樹脂の埋め込みおよびポストの染色のためのプロシージャを選びました優れた画像コントラストを実現します。注目すべきは、新生児ラット脳組織で作業する場合、微細 ultrastructure の保存は特に困難な場合があります。実際には、非常に若い動物の中枢神経系は、成体の脳よりも高い水分含量、細胞外空間のより顕著な拡大、および細胞12間のより緩い接続によって特徴付けられる。これにより、新生ラット脳組織はオスモル濃度の変化に深く敏感であり、異なる張度12の逐次溶液を通して処理されたときに、artifactual 収縮および/または腫脹を生じやすい。したがって、我々の方法は、ラット新生児の脳のそれにできるだけ近いオスモル濃度の標本処理のためのソリューションを採用しています。私たちの目標は、神経末端のシナプス小胞空間分布を定量的に評価する高品質・高分解能の電子顕微鏡像を得ることでした。具体的には、神経終末内の小胞の数、シナプス前の形質膜からのシナプスの小胞の距離、シナプス前膜に停泊している小胞の数、シナプス小胞の大きさ、間小胞距離1.
十分な化学的固定は、シナプス小胞形態および空間的組織を研究するために必要な形態学的詳細を提供することができる高品質の電子顕微鏡写真を得るための前提条件である。固定のいくつかのモードが存在するが、血管灌流による脳組織の固定は、他の方法より明らかに優れている。血管灌流による固定は、全身循環の停止の直後に始まるので、脳組織の脱酸素とタンパク質の固定剤との架橋の間の間隔が短くなり、細胞内での最小変化が生じる構造。さらに、それは、血管床から細胞外および細胞区画12、13、14までの固定液の急速な流れのために、迅速かつ均一な浸透を達成する。グルタルアルデヒドとの主な固定は、続いて、四酸化オスミウムとの二次固定 (後固定) によって、微細構造15,16,17の優れた保存をもたらす。グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドの混合物は、組織12へのより迅速な浸透の追加の利点を有する。
生物学的組織は、樹脂マトリックスを支持せずに薄い切片に切断するのに十分な剛性がないので、薄い断面化する前に培地に埋め込まれている必要がある。水非混和性エポキシ樹脂は、TEM に埋め込み媒体として一般的に使用されている。このタイプのマトリックスを使用する場合、すべての試料の自由水は、樹脂浸潤の前に有機溶媒に交換する必要があります。水は、エタノールおよび/またはアセトン12の上昇濃度の一連の溶液を通して標本を通過させることによって除去される。この議定書では、標本は柔軟な aclar シートの間で最初に平らに埋め込まれ、次にカプセルに埋め込まれる。最終結果は円筒形樹脂ブロックの先端に位置する組織で、ミクロトームの断面化中に生じる振動の影響を最小限にする理想的な形状を有しています。
内因性組織のコントラストを高めるために重金属で染色することは、試料調製のもう一つの重要な側面です。TEM における画像コントラストは、組織内の原子による電子散乱によるものである。しかし、生物学的材料は、主に、低原子量分子 (すなわち、炭素、水素、酸素および窒素) からなる。したがって、十分な散乱コントラストの生成は、組織の細胞成分に高い原子量の原子を組み込むことを必要とする。これは、重金属12、18、19を用いた試料の染色によって達成される。脂質に強く結合するオスミウム四酸化、ウラン、鉛は、電子染色として用いられる最も一般的な重金属です。
オスミウム (原子番号 76) は、存在する最も密金属の一つです。それは、固定剤および染色剤の両方であり、TEM におけるその主な役割は、信頼性の高い定着性12としてである。使用中の様々な固定プロトコルの中で、オスミウムに続くグルタルアルデヒドとの二重固定の方法は、検体調製中の細胞成分の抽出を減少させるのに最も効果的である。これらの2つの固定剤は、異なる種類の分子、特にタンパク質および脂質の最大数を安定化するために使用され、組織 ultrastructure の優れた保存をもたらす12、14、15、16,17.
ウラン (原子番号 92) は、電子染色として使用される最も重い金属であり、最も典型的には酢酸ウラニルの形態である。オスミウムと同様に、それは、染色剤および固定剤として作用し、TEM におけるその主な役割は、染色20、21としてのものである。核酸含有および膜構造は、アルデヒド固定組織22、23においてウラニル塩で強くかつ優先的に染色される。Osmication および脱水前のウラニルによる組織の治療は、膜および核酸含有構造の安定化、ならびに強化されたコントラストをもたらし、そして、そうではないいくつかの構造的な細部の同定を可能にする、オスミウム単独で染色された検体においては12,24,25に容易に検出することができる。酢酸ウラニルは、osmication24中に脂質膜上に堆積した低オスミウムと組み合わせることで微細な構造を安定化させることが考えられる。最大コントラストは、ウラニル酢酸が埋め込む前に適用され、薄いセクション12でポストステインとして達成されます。
鉛 (原子番号 82) TEM のために使用される最も一般的な染色であり、主に薄い切片の後染色のために採用されています。鉛塩は、高い電子不透明度を有し、膜、核および細胞質蛋白質、核酸及びグリコーゲン26、27を含む細胞構造の広い範囲のための親和性を示します。二重染色法が採用されている場合 (すなわち、ウラニル酢酸塩による染色は、鉛による治療が続く)、後者はウラニル酢酸染色の開発者として作用する。例えば、グルタルアルデヒドによって固定されたクロマチンのリードポスト染色では、ウラニルの酢酸摂取量は28、29、30、31、32の3倍に増加します。鉛はまた、オスミウムなどの他の金属によって付与される染色を増強する。鉛塩は、減少したオスミウム33の存在下でホスファチドの極性基に付着することにより、オスミウム固定組織の膜を染色すると考えられている。酢酸ウラニルおよび鉛の両方による染色の潜在的な欠点は、特に長期間にわたって、多くの異なる構造的な要素が等しくかつ非特異的に染色され、したがって、互いに容易に区別できない可能性があることである12.
光学超解像の写真活性化された局在の顕微鏡検査のような代わりとなる光源の最近の導入は、かなり改善される光顕微鏡検査の決断を持っている34。しかし、光顕微鏡は、個々に標識されたタンパク質または酵素を視覚化するために組織化と免疫 cytochemical 法に依存しているため、TEM の力は、一度にすべての構造要素を表示するために、そのままの綿密な研究のために卓越しています。組織構造の形態と寸法関係特に、他の技術は、シナプス前神経 boutons におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析を行うために必要な形態学的詳細を提供することができる。それにもかかわらず、電子顕微鏡写真は、生物が死亡した後に組織の構造を捕捉し、したがって、シナプス前小胞輸送およびエキソサイトーシスのダイナミクスに関する情報を提供することができないことに注意することが重要である。したがって、FM 色素ライブイメージングやパッチクランプ電気生理学などの他のツールは、主な目的がシナプス小胞輸送およびエキソサイトーシスの動的および/または機能的側面を研究することであると考える必要があります。
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Protocol
すべての研究は、バージニア大学 (シャーロッツビル、VA) の機関の動物のケアと使用委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施しました。
1. 血管灌流による固定
注:ラット脳血管灌流のための方法の一般的な説明は、このジャーナル13で既に詳述されており、このプロトコルの範囲を超えている。しかし、以下のステップは、新生ラット脳組織の調製に特異的であり、シナプス前末端におけるシナプスベシクル分布の定量分析のための高品質の電子顕微鏡写真を得る。
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4% のパラホルムアルデヒドを準備する
- 800 mL の 0.1 M のリン酸緩衝液 (PB) を、ヒュームフードの下にある攪拌プレート上の 2 L ガラスビーカーに入れます。バッファーを沸騰させずに約60° c まで加熱します。
- パラホルムアルデヒド粉末の 40 g を追加します。攪拌連続
- PH を測定しながら、溶液がクリアされるまで 10 N NaOH の小さな滴を加えます。最終的な pH は 7.2-7.4 でなければなりません。
- 残りの 0.1 M PB を最終ボリューム 1 L に追加します。冷却して、0.45 μ m の膜でろ過し、4° c で一晩保存します。
注:灌流の前日に新鮮なパラホルムアルデヒドを準備します。
注意:アルデヒド蒸気を吸入すると、鼻症状や気道刺激を引き起こすことがあります。皮膚に接触すると皮膚炎を引き起こす。アルデヒドは、手袋、保護ガウンと安全ゴーグルを着用しながら、ヒュームフードで処理する必要があります
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Tyrode ソリューションの準備
- ガラスビーカーに蒸留水1リットルを攪拌板の上に置きます。NaCl (8g)、KCl (0.15 g)、CaCl2 (0.1 g)、MgCl2 (0.006 g)、ノー2ポー4 (0.055 g)、NaHCO3 (1g) 及びデキストロース (1g) をビーカーに添加する。
- 連続撹拌し、pH を測定します。7.2 と7.4 の間に pH を保ちます。
注:Tyrode ソリューションも市販されています。
- 4% のパラホルムアルデヒドをグルタルアルデヒドと混合し、最終濃度を 2% にします。40 mL の電子顕微鏡検査グレード 50% のグルタルアルデヒドを 4% パラホルムアルデヒドの 1 L に加えます。攪拌板によく混ぜる
注:パラホルムアルデヒド-グルタルアルデヒドの固定液溶液の約 100 mL は、新生ラットの体を perfuse するために必要である。したがって、少なくとも10匹の新生ラットは、1 L の固定剤で灌流することができる。使用する直前までパラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを混ぜないでください。灌流する前にすべての溶液を室温に戻してください。 - 左心室へのアクセスが得られたら (全動物灌流プロトコル13を参照)、120 mmHg の灌流圧力で 30 s の Tyrode 溶液で血管系を洗い流す。
注:灌流の成功は、血管床からの血液の完全な排除に一部依存する - 10分間同じ圧力でパラホルムアルデヒド-グルタルアルデヒド溶液で洗い流す。
注:絶え間ない灌流圧の維持は、アーチファクトの導入を避けるために不可欠です。さらに、血管収縮を避けるために、灌流液の温度はラットの体温以下であってはならない - 頭蓋骨から固定された脳を除去し、新鮮なパラホルムアルデヒド-グルタルアルデヒドに入れて4° c で一晩します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
2. ブレインスライシング
- 4% アガロースに固定された脳を埋め込み、ビブラトームのステージに脳-アガロースブロックを接着
注:他の実験室は寒天サポートなしでビブラトームの安定したブロックを達成することによって良質のセクションを得た - 50μ m の厚さのセクションスライス。ミクロトームを低周波と低速に設定します。
注:セクションは、数年間、4° c で 0.05% アジ化ナトリウムで 0.1 M PB で保存することができます。 - ペトリ皿の 0.1 M PB のセクションを置き、解剖顕微鏡の下のセクションを調べ、埋め込むための標本を選びなさい
注:プロトコルはここで一時停止することができます。
3. リンス
注:残留固定剤は、オスミウム沈殿物を生成する可能性があるため、アルデヒドとの固定後およびオスミウムでの後固定の前に、試料をすすぐことが重要です
- ピペット 0.1 M PB を、キャップ付きの幅広の広口ガラスバイアルに挿入します。各バイアルごとに1つの標本を置きなさい。それが乾燥しないように、試料を完全にカバーしています。
注:固定、脱水、浸潤のすべてのソリューションの変更は、フラット埋め込みの準備が整うまで、このステップから同じバイアルに標本を保管してください。 - 0.1 M PB の試料を3分 x 2 で洗浄し、マイクロピペットで PB を除去します。
注:新生ラットの脳はオスモル濃度12、35、36、37の変化に深く敏感であるので、固定液混合物で使用されるものと同じビヒクルで洗浄剤を行う
4. オスミウムとの事後固定
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四酸化オスミウムの調製 (OsO4)
注:この著者の研究室は、ガラスアンプルで水溶液で供給 OsO4 4% を利用しています (OsO の 5 mL の4 4% H2O).他のラボは正常に OsO4結晶を使用しています。しかし、数時間は、車両に OsO4結晶を溶解するために必要です。- 4% OsO4/H2O の 5 mL (1 アンプル) を取り、それを開き、茶色のガラス瓶に置きます
注:OsO4は、強力な酸化剤であり、光への暴露によって容易に減少する。OsO4を褐色のガラス瓶に入れることにより、調製時の低減を回避できます。 - 0.2 M PB の 5 mL を追加します。これは 2% OsO4/0.1 M PB の 10 mL を得ます。
注:新生ラットの脳はオスモル濃度の変化に深く敏感であるため、同じバッファーを使用してアルデヒド固定剤および OsO4溶液12,35,36,37 を調製します。 - 0.1 M PB の追加 10 mL を追加します。これは 0.1 m PB の 1% OsO4の 20 mL の最終的な解決をもたらす。
- 1% OsO4を描画し、茶色のガラス瓶またはアルミホイルで覆われた scint バイアルにそれを置くために長い針を装着した 20 mL のシリンジを使用してください。
注意:OsO4は非常に揮発性であり、そのガスは、鼻、目や喉に有毒です。すべての作業は、手袋と防護服を使用してヒュームフードで実行する必要があり、ボディ部分は OsO4にさらされるべきではありません。取り扱いや廃棄物の処理は、教育機関のガイドラインに従って行う必要があります。未使用の OsO4を、ガラス栓にテフロンライナー付きのしっかりと栓茶色のガラス瓶に保管し、ボトルを二重アルミホイルで包み、dessicator に保管します。ガス漏れの存在下で、OsO4は、冷蔵庫の内部表面および内容物を変色させることができます。上記の貯蔵条件下では、OsO4溶液は数ヶ月間安定である。溶液が貯蔵中に酸化されると、それらは灰色になり、その場合は廃棄される必要があります。
- 4% OsO4/H2O の 5 mL (1 アンプル) を取り、それを開き、茶色のガラス瓶に置きます
- 0.1 M PB 中に 1% OsO4を加え、バイアルで1時間マイクロピペットして1時間 OsO 抽出した。
注:セクションに OsO4を適用する前に、標本を展開し、平らにすることは重大である。試料の上に直接アプリケーションを避け、代わりにバイアルの底部に OsO4を優しく滴下するバイアルの壁を使用してください。標本は OsO4の適用の後ですぐに茶色および堅くなる。ティッシュの損傷を避けるために今から穏やかに扱いなさい
5. リンス
注:残留固定剤が脱水剤37と反応することがあるので、OsO4および脱水前に、後固定の後に標本をすすぐことが重要です。
- 3分 x 3 の 0.1 M PB ですすいでください。
注:新生ラットの脳はオスモル濃度の変化に深く敏感であるため、定着性混合物12,35,36,37に用いられているものと同じビヒクルで洗液を行う。 - OsO4廃棄物にオスミウム溶液と最初の 2 PB リンスを配置し、あなたの教育機関のガイドラインに従って処分します。
6. 酢酸ウラニルによる連続脱水および染色
注:この著者の研究室は、埋め込み用の水非混和性エポキシ樹脂を使用しています。エポキシ樹脂を使用する場合は、包埋剤による浸透前に、すべての検体の自由水を有機溶媒に置換する必要があります。水は、エタノールおよびアセトン12の上昇濃度の一連の溶液を通して標本を通過させることによって除去される。
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酢酸ウラニル (UA) の調製
- 攪拌プレート上に 100 mL の Etoh 中 70% を含有する 200 mL の容積式ガラスフラスコを置きます。
- フラスコに UA の 4 g を加えます。アルミホイルで包む (UA は光にさらされると沈殿する)、連続的に攪拌する。
注:UA は 70% の Etoh 中でゆっくりと不完全に溶解する。溶解していない結晶が溶液を使用する前に落ち着くようにします。UA 溶液は、使用前に0.45 μ m フィルタで濾過する必要があります。UA は事前に調製することができ、4° c でアルミ箔で包まれた茶色のボトルに数ヶ月間保管します。
注意:UA は軽度の放射性で毒性が強い。UA 粉末の吸入は、上気道の障害および肺、肝臓および腎臓の疾患を引き起こす可能性がある。摂取すると、または皮膚や粘膜と直接接触する場合、UA は危険です。すべての作業は、手袋と防護服を使用して、ヒュームフードで実行する必要があります。取り扱いや廃棄物の処理は、教育機関のガイドラインに従って行う必要があります。
- 50% の Etoh 中で1分間脱水し、UA を追加する前に 50% Etoh 中を除去します。
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70% の Etoh 中で 4% UA を追加します。1時間または一晩座ってみましょう。夜間の場合は、冷蔵庫に4° c で置きます。
注: etoh 中の蒸発を避け、光への暴露を避けるためにアルミホイルで覆うキャップバイアル。プロトコルはここで一時停止することができます。- あなたの教育機関のガイドラインに従って、UA 廃棄物と次の2つのリンスを処分してください
- 70% の Etoh 中で1分間脱水します。
- 90% の Etoh 中で5分間脱水します。
- 100% の Etoh 中で5分 x 2 の脱水を行います。
- 試料をアセトンで2分間洗浄します。
7. 浸透と埋め込み
注:ティッシュは樹脂のマトリックスの付加的なサポートなしで薄いセクションに切られて十分に堅いではない。したがって、浸潤および埋め込みは、セクション12に先行しなければならない。
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EPON 樹脂の調製
- 60 mL gavage シリンジを使用してください。シリンジを取り外し、安全針でシリンジをキャップします。
- 開いた側面が付いているスポイトを置き、徐々に樹脂の混合物の各材料の容積を加えなさい。埋め込み-812 (レジン) の 22 mL を追加します。37 mL の総容積に DDSA (硬化剤) を加えなさい。50.5 mL の総容積に NMA (硬化剤) を加えなさい。ピペットで525μ l の DMP-30 (アクセラレータ) を加えます。DMP は非常に粘性であるため、ピペットのプランジャーを非常にゆっくりと移動させることができます。
注:記載されている順序で埋め込み試薬を追加することは重要です。アクセラレータ (DMP-30) は最後に追加する必要があります。所望の特性を有する硬化ブロックを得るためには、硬化剤とアクセルの正確な量を使用することが重要である。作りたての包埋混合物が好ましい。 - プランジャーを戻し、少なくとも30分間連続して揺れているロッカーにシリンジを置きます。色は黄色から黄色に変わります。
注:すべての成分は非常に徹底的に混合する必要があります。これを怠ると、組織標本の不均一な含浸が生じ、凹凸硬度のブロック
- Scint バイアルに1体積のアセトンと EPON 樹脂の1体積を混合し、混合する振ります。最後のアセトンリンスを取り除いた後の組織に 1:1 EPON: アセトン混合物を塗布してください。アセトンの蒸発を避けるためにカバーしてください。2-4 h の後に樹脂とアセトンの1:1 混合物を除去するか、または一晩保管してください。
注:プロトコルはここで一時停止することができます。 - レジンとアセトンの混合物を完全な樹脂と交換してください。4時間または一晩座ってみましょう。コレクション容器内のすべての EPON 廃棄物を、後に重合して廃棄するためにフードの下に置く。
注:プロトコルはここで一時停止することができます。
8. フラット埋め込み
注:2つの aclar フィルムの間には、サンドイッチのような方法で、標本がフラットに埋め込まれています。
- 2枚の長方形の透明な aclar シートをカットします。Etoh 中 70% できれいにフィルムを拭いてください。セクションのすべての側面のティッシュなしのプラスチックの少なくとも 1.5 cm があるようにシートをトリムしなさい。上の aclar シートは、底部と同じ幅を持つ必要があり、その高さは、ボトムシートの約3分の2でなければなりません。
- 試料でバイアルをゆっくりと傾け、ガラスびんの底部からゆっくりと組織を持ち上げる。
- 慎重にバイアルの壁に沿ってセクションを移動し、aclar シート上に転送するために、マイクロ柔軟なスパチュラと細かいブラシを使用してください。
注:標本の損傷を避けるために慎重にセクションを扱いなさい。 - Aclar シートを試料の上にそっと置きます。
注:サンドイッチを密封するために2枚のシートの間に十分な樹脂があることを確認してください - セクションに直接圧力を加えることなく、閉じ込められた気泡をそっと押し出します。余分な EPON を拭き取ります。
注:気泡の除去が重要であり、それらの存在は、試料の可視化が困難であり、樹脂結合の安定性を弱める。 - 耐溶剤性のペンでシートにラベルを付け、60ͦC のオーブンで重合に2-3 日間置きます。
注:プロトコルはここで一時停止することができます。
9. カプセル包埋
注:Ultramicrotomes は、カプセルに埋め込む標本から得られる円筒ブロックを保持するためにチャックが付属しています。円筒ブロックは、断面化中に生じる振動の影響を受けない理想的な形状をしています。
- 挟まれた aclar フィルムをそっと開きます。標本は2つの aclar シートの1つに付着する。
- 耐溶剤性のペンを使用して、セクションを含む aclar シートの側面をマークします。ティッシュの近くに印をつけなさい。
注:目的の組織を打ち抜く前に、このステップを実行することが重要です。 - ディスクパンチを使用して、断面の円サンプルを取得します。ペンマークは、パンチアウト組織の一部である必要があります。
- 包埋カプセル側のキャップをカプセルホルダー上に準備します。キャップに樹脂の滴を置きます。
- ティッシュセクションを上向きにして、パンチディスクをキャップの内側に置きます。試料の上に光が輝いているとき、ペンマークは輝きます。
- キャップにカプセルを挿入し、細かいピンセットを使用してラベリングを挿入します。印刷された2cm の長さの紙を、カプセルに転がして下ろします。カプセルの側壁の曲率に合わせてラベルを作成します。ラベルが樹脂に永久的に埋め込まれるように、重合が完了するのを待ちます。
- 包埋樹脂をカプセル内に注ぎ、カプセルの端まで充填します。
- 先に尖った木の棒の助けを借りてカプセルの底にティッシュの標本を押し、2-3 日の60° c のオーブンで置きなさい。
注:組織を硬くしすぎないように注意し、組織とカプセル表面の間に埋め込み媒体の薄層が存在するように緩くしておきます。プロトコルはここで一時停止することができます。
10. ブロック面のトリミング
注:ブロックの表面の小さいサイズそして適切な形は十分な区分のための前提条件である。従って、標本ブロックのトリミングは必要である。
- 鋭い1エッジかみそりの刃を使用してください。使用直前にアセトンを洗浄してください。
- ブロックホルダにカプセルブロックを取り付け、実体顕微鏡のステージ上にブロックホルダを置きます。
注:トリミング手順は、顕微鏡双眼鏡と斜め照明の下で行われるべきです。 - かみそりの刃を使用して、カプセルの先端から aclar シートを取り外します。Aclar シートは、解剖スコープの光の下に光沢のある層として表示されます。
- 45度の角度でかみそりの刃を保持し、カプセルブロックの4つの側面をカットしてください。
注:刃が両手で保持されている場合、トリミングのより良い制御が達成されます。 - ブロックが約45°の壁角度を持つ短いピラミッドの形を取るように、短いカットを行います。
注:それに通じる側面が短く保たれれば標本の表面はずっとよりよく支えられる。ブロック先端が薄すぎると長い場合、それは薄い断面の間に振動します。理想的には、目的の領域をブロック面の中央に配置する必要があります。 - 余分なティッシュを捨てるためにカプセルの先端をトリミングし、唯一の関心領域を保持します。
注:ブロック面の密度の変動が断面の難しさの主な原因であるように、セクションのどの部分は、組織なしでなければなりません。理想的には、カプセルの表面の表面積は 1 mm2以下でなければなりません。 - カプセルの表面を不等辺三角形台形の形に整えます。不等辺三角形台形ではない側が等しいので、この形状は、標本の残りの部分に関連する関心領域を配向させるのが最善です。
注:断面化中に、台形形状の面は、他の形状のものよりもはるかに優れてサポートされています。
11. ミクロトームの区分
注:生物学的標本の大部分は、その自然状態において厚すぎて電子線で貫通する。したがって、材料は、電子ビームによって貫通することができる薄いセクションで切断されなければなりません。
- 表面に平行な平面でウルトラミクロトーム上の薄い切片 (銀色の干渉色、600-900 Å) を切ります。
- グリッドにセクションを配置します。この著者の研究室は、外径3.05 ミリメートルの銅格子を使用しています。
注:プロトコルはここで一時停止することができます。
12. 酢酸ウラニルによるポスト染色
- 蒸留水で 2% UA を準備します。100 mL の蒸留水を攪拌プレートに入れた 200 mL ボリュームガラスフラスコを置きます。フラスコに UA の 2 g を加えます。アルミホイルで包む (UA は光にさらされると沈殿する)、連続的に攪拌する。
注:UA 準備の詳細については、このプロトコルのセクション6を参照してください。 - 2% の個々の滴をペトリ皿の歯のワックスのきれいなシートに置きなさい。
- 25分間 UA の一滴に試料 (セクション側下) でグリッドをフロートさせる。
注:UA の別々のドロップ上に各グリッドを浮かべます。 - プラスチック製の洗浄ボトルから室温で沸騰した蒸留水の穏やかなジェットの下で鉗子と2回洗浄し、その端にグリッドを保持します。
注:リードで染色する前にグリッドを乾燥させないでください。
13. 鉛による染色後
- CO2 フリーチャンバーを準備します (空気中の co2 は鉛沈殿の主要な供給源です)。濾紙をペトリ皿に 1 N NaOH で浸したものを置きます。きれいな歯科用ワックスを濾紙の上に置いて、複数の NaOH ペレットを皿の片側に置きます。皿を覆いなさい。
注:グリッドが UA で染色される前にこの設定を準備し、チャンバー内の雰囲気が CO2を含まないようにし、UA 染色が完了するまでにリード染色の準備を整えます。 - 4% NaOH を作る。0.2 g の NaOH を蒸留水 5 mL に追加します。
- 佐藤のトリプルリードソリューションを準備します。10ml を調製するために、0.1 g の鉛硝酸、0.1 g のクエン酸鉛、0.1 g の酢酸鉛および 0.2 g のクエン酸ナトリウムをガラス瓶に加える。蒸留水8.2 を加え、5分間激しく振って30秒間超音波処理し、次いで新しく作られた 4% NaOH の 1.8 mL を加える。
- シャーレのワックスに、佐藤さんのリードを数滴入れます。
- リードのドロップの上に、UA (セクション側) でグリッドを染色します。
注:各グリッドは、リードの別のドロップでフローティングする必要があります。各ドロップは、グリッドが側面にスライドダウンするのではなく、ドロップのドームの上に浮かぶことができるように十分に小さい必要があります。 - 皿を覆い、5分間染色をしてください。
- ピンセットでグリッドを持ち、プラスチックの洗浄ボトルから室温で沸騰した蒸留水の穏やかなジェットの下で徹底的に洗ってください。
- フィルター用紙のグリッドを乾かし、グリッドを保存します。
注:セクションがフィルター用紙と直接接触しないようにしてください。
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Representative Results
TEM 用の検体の保存が良好または不良の指標として主に認められている一般的な基準が確立されている。これらの基準は、4つの選択された電子顕微鏡写真 (最適な調製の2つの例、欠陥製剤の2つの例) において、このプロトコールに記載された方法に従って若年ラット脳組織を処置することによって得られる。
一般に、良質の電子顕微鏡写真は、整然とした、明瞭で、全体的に灰色がかった画像として現れる。良好に調製された標本では、膜間の空間は粒状物質で満たされるべきであり、空であってはならない。同様に、細胞内の基底物質または細胞小器官の中に空のスペースが見つからないようにします (図1aと図2aを図3および図4と比較してください)。それにもかかわらず、非常に若い動物の中枢神経系は、成体の脳と比較したときの細胞外空間の拡大のある程度を示しており、細胞間のより緩やかな接続と全体的に白く、より少ない電子緻密な外観。膜は、歪みや破損なしで連続的でなければなりません (図 1aと図 2a)。ミトコンドリアの間質は、空のスペースで、均一かつ密に表示されるはずです。クリステは無傷で膨潤せず、ミトコンドリア外側二重膜は途切れないようにすべきである (図1aを図 3と比較する)。シナプス前の小胞組織の morphometric 分析を容易にするために、シナプス前後の膜は無傷で本質的に平行である必要がある (図 1参照)。シナプス小胞は、連続的な単一膜によって追跡可能かつ結合されなければならない (図 2参照)。
重要なのは、ベストプラクティスに従っている場合でも、固定剤、シミ、樹脂を用いた検体の治療はアーティファクトをもたらします。アーティファクトを除去することはできないので、どのプロセスが発生したのかを理解することが重要であり、標本の出現が12を受けた治療に関して解釈されることができる。人工物の一例-TEM のための標本調製の間に生成することができるいくつかの中で-ミエリン図、ミエリン鞘に似た膜ラメラ封入です。ミエリンの数字は病理学的条件12で見ることができるが、それらはアルデヒドとの固定中の膜脂質の抽出によって生じることが最も多い (図 4参照)。
図 1: 電子顕微鏡写真は細胞構造の十分な保存を代表する (実施例 1)。(A) 神経細胞膜は層状で、破断がない。細胞質は細かく粒状であり、空のスペースはありません。ミトコンドリアは腫れも縮んでもない。外側の二重膜は保存されており、内部のクリステは無傷です。(B) パネル A の詳細は、シナプス前膜からのシナプス小胞の距離を測定するための1つの方法例示。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 電子顕微鏡写真は細胞構造の十分な保存を代表する (実施例 2)。(A) シナプス小胞は、明瞭で、切れ目のない単一の膜によって裏打ちされる。シナプス小胞分布の morphometric 分析を可能にするために、シナプス前およびシナプス後の膜は平行であり、連続性が維持される必要があります。(B) パネル A の詳細、例示は、シナプス前末端内のシナプス小胞のカウントを計算する。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 電子顕微鏡写真は組織構造の欠損保存を代表する (実施例 1)。神経細胞膜の歪みや破損、および著しく拡大した細胞外空間の存在 (* でマーク) に注意してください。ミトコンドリアは膨張に表示され、クリステが腫れています (矢印でマーク).この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 電子顕微鏡写真は組織構造の欠損保存を代表する (実施例 2)。微細な細胞質物質の代わりに、細胞質内の大きな白い空のスペース (ǂでマーク) の存在に注意してください。細胞外スペースは拡大して現れる。Artifactual 膜 whorl (ミエリン図) は、グルタルアルデヒドとの固定中に脂質の動員から生じる可能性が高く、頭字語の略語でマークされている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
TEM のための試料調製中の組織切片の処理は、かなりの程度の技巧、濃度および忍耐を必要とする。マイクロピペットを使用して溶液を添加および除去する場合、試料は表面張力によってピペットチップに吸入される可能性があるので、ピペットによる組織損傷を避けるために細心の注意が必要である。また、脱水シーケンスの特定のステップは、1分として迅速であることができるので、オペレータは、次の脱水ステップが時間通りに開始され、検体が乾燥またはしわにならないことを確実にするために迅速に作業する必要があります。特別な注意を必要とする1つの手順は、オスミウムとの事後固定です。セクションは、オスミウムでの処理後に硬くなり、容易に損傷することができます。オスミウムを追加する前に、セクションがバイアルの底部に平坦化されることが不可欠であり、他の任意の折り目は、組織の骨折をもたらすでしょう。Osmicated のティッシュの処理は平らな埋め込みのための aclar のフィルムにセクションを移すとき特に挑戦的である。断片化を避けるために、バイアルの底から試料を持ち上げるときや、フィルムサンドイッチから気泡を押し出すときには、特別な注意が必要です。閉じ込められた空気を押し出すことは重要であるが、検体の可視化が困難であり、樹脂結合の安定性が弱まるため、osmicated 組織上への直接的な圧力は容易に損傷を与えることができる。余分なケアをすることをする別のステップは、試料の浸潤および埋め込みのための樹脂混合物の調製である。EPON は、最も広く使用されている埋め込み樹脂であり、硬化剤およびアクセルの添加により硬化させることができる。所望の特性を有する硬化ブロックを得るためには、硬化剤および加速器の正確な量を使用することが不可欠です。粘稠性および容積式の両方の方法は、粘性樹脂を測定するために記載されています。重量測定法は伝統的により正確な12と考えられているが、この著者の研究室は、体積モードで良好な成功を収めている (すなわち、gavage シリンジによって樹脂混合物の各成分の体積を漸増的に加える).樹脂成分を注意深く測定した後、それらは異なる粘度および重合速度を有するので、均一な含浸を達成するために非常に徹底的に混合されなければならない。完全な混合を達成するために失敗は薄い区分のために不適当である不均等な硬度のブロックで起因する。
若いラット脳の切片を処理するために使用される溶液の張度における著しい変化は、細胞外空間および細胞成分の収縮および/または腫脹を引き起こす可能性がある12,35,36,37.固定の間に、最もよい結果は灌流液の浸透圧が研究の下のティッシュのそれにできるだけ同じように保たれるとき得られる。ラット脳オスモル濃度はおよそ 330 mOsm である。0.1 M PB 溶液中の 2% グルタルアルデヒドはわずかに高張 (400-450 mOsm) であり、血管外空間12の膨張を最小限に抑えます。特に、膜は、アルデヒドとの固定後のすすぎおよび脱水溶液の浸透圧の変化に敏感なままである。したがって、固定液のオスモル濃度とその後に使用される溶液12、35、36、37の間の差異を最小限に抑えることも重要である。このため、同じ車両 (0.1 M PB、おおよそオスモル濃度 440 mOsM) がこのプロトコルの全ての溶液の溶媒として使用される。しかし、いくつかの異なる緩衝液は TEM のための試料調製中に首尾よく使用されており、単一バッファは他のものよりも普遍的な優位性を主張することができないことに留意すべきである。より低い張度のバッファーが好ましい場合、他の実験室は、電解質または非電解質12を用いてオスモル濃度を増加させることを選択した。
このプロトコルのいくつかのステップは、適切に処理されていないときに有毒であり得る化学物質の使用を必要とします。アルデヒド、オスミウム、ウラン、鉛化合物を処理しながら、ヒュームフードの下で作業し、個人的な保護具を身に着けていることの重要性を誇張することはできません。自動対照的なシステムは、リスクの一部を減衰させることができ、市販されているが、彼らは非常に高価であることができ、TEM のルーチン使用をしない研究所によって手頃な価格ではないかもしれません。電子顕微鏡の実験室は危険な場所である可能性があるが、厳密に行われたとき TEM のための標本処理は全体的に安全である。
近年、超解像光学顕微鏡の導入により、約 15 nm34の光イメージング分解能が向上している。しかしながら、シナプス前末端におけるシナプス小胞空間組織の morphometric 分析を行うことが目的である場合、いかなる技術も同程度の形態学的詳細を提供しない。重要なことに、TEM は、処理して視覚化することができる前に試料が死んでいる必要性によって制限される。したがって、研究目的がシナプス小胞の人身売買およびエキソサイトーシスの動的または機能的側面を調査することである場合、TEM 以外のツールが考慮されるべきである。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この原稿は、NIH/NIGMS K08 123321 (to N.L.) とバージニア大学麻酔科からの資金によって支えられました。研究者は Erisir (Alev、バージニア大学、シャーロッツビル、VA) に感謝し、TEM での優れたトレーニングと技術支援のために、そして、彼女の貴重な原稿批評のためにありがとうと思っています。また、バージニア大学の高度電子顕微鏡検査施設では、検体の断面化と染色後の技術支援にも感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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