我々は、新生ラット脳組織を処理して、神経終末におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析のための高分解能電子顕微鏡写真を得るための手順を説明する。これらの方法で得られた顕微鏡写真は、多数の他の細胞成分およびそれらの寸法構造関係の形態を研究するためにも使用することができる。
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方法論記事
Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析
この記事について
サマリー
要約
私たちの研究室や他の多くは、シナプス小胞の形態と空間的組織化を研究するために、透過型電子顕微鏡検査の高い分解力を利用しています。シナプス前小胞分布の定量分析に必要な形態学的詳細の程度を得られる高品質の電子顕微鏡写真を得るためには、最適な試料調製が重要である。化学的固定は、試料調製のプロセスの第一歩であり、微細な ultrastructure を維持するために最も重要です。グルタルアルデヒド溶液を用いた血管固定、続いて四酸化オスミウムを用いたビブラトーム切片標本の治療により、分子の最大数、特にタンパク質と脂質を安定化し、優れた保存をもたらすの ultrastructure。その後、組織は、切片、シーケンシャル脱水および樹脂包埋で処理されます。酢酸ウラニル (すなわち、樹脂埋め込み前のビブラトームによる組織の染色) による En ブロック染色は、内因性のコントラストを高め、検体処理中の抽出に対して細胞成分を安定化させます。コントラストは、超薄断面の後染色として酢酸ウラニルを適用することによってさらに増加させることができる。酢酸ウラニル処理後のクエン酸鉛を用いた極薄の切片の二重染色により、ウラニルへの鉛の選択的結合による核酸含有構造の電子不透過性を強化することにより、画像分解能も向上させる。透過型電子顕微鏡法は、シナプスベシクルの形態学的詳細の特徴付けと、末端 bouton におけるそれらのサイズおよび空間的組織の定量化のための強力なツールである。しかし、固定された組織を使用しているため、透過型電子顕微鏡は、生きているプロセスや進化する過程に関する間接情報しか提供できません。したがって、主な目的は、シナプスの小胞の人身売買およびエキソサイトーシスの動的または機能的側面を研究することである場合、他の技術を考慮する必要があります。
概要
我々は、新生ラット脳組織の調製方法について、神経ターミナル1、2におけるシナプス小胞空間分布の詳細な morphometric 分析のための高品質の電子顕微鏡写真を得るために記述する。これらの方法に従って検体を処理することによって得ることができるハイコントラスト顕微鏡写真は、多数の細胞成分およびそれらの寸法構造関係3,4の詳細な形態を研究するためにも使用することができる。
透過型電子顕微鏡 (TEM) は、オルガネラや他の細胞構造の形態を定量的に研究する強力なツールです。この十年のように、高圧凍結による cryofixation を除いて、免疫タグ付けなしで脂質膜およびオルガネラの同じ程度の分解能を提供できる他の調査方法はない。しかし、凍結置換技術は広く使用されておらず、通常は高価な装置と長い準備時間を必要とします。
TEM の高い分解力を活かすためには、最適な試料調製が最も重要です。検体調製の主な目的は、生体状態からの変化を最小限に抑えて組織構造を保存し、検体のコントラストを高め、処理中の細胞成分の抽出や電子への曝露に対する組織の安定化を図ることである。ビーム。TEM のティッシュの準備....
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プロトコル
すべての研究は、バージニア大学 (シャーロッツビル、VA) の機関の動物のケアと使用委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施しました。
1. 血管灌流による固定
注:ラット脳血管灌流のための方法の一般的な説明は、このジャーナル13で既に詳述されており、このプロトコルの範囲を超えている。しかし、以下のステップは、新生ラット脳組織の調製に特異的であり、シナプス前末端におけるシナプスベシクル分布の定量分析のための高品質の電子顕微鏡写真を得る。
-
4% のパラホルムアルデヒドを準備する
- 800 mL の 0.1 M のリン酸緩衝液 (PB) を、ヒュームフードの下にある攪拌プレート上の 2 L ガラスビーカーに入れます。バッファーを沸騰させずに約60° c まで加熱します。
- パラホルムアルデヒド粉末の 40 g を追加します。攪拌連続
- PH を測定しながら、溶液がクリアされるまで 10 N NaOH の小さな滴を加えます。最終的な pH は 7.2-7.4 でなければなりません。
- 残りの 0.1 M PB を最終ボリューム 1 L に追加します。冷却して、0.45 μ m の膜でろ過し、....
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結果
TEM 用の検体の保存が良好または不良の指標として主に認められている一般的な基準が確立されている。これらの基準は、4つの選択された電子顕微鏡写真 (最適な調製の2つの例、欠陥製剤の2つの例) において、このプロトコールに記載された方法に従って若年ラット脳組織を処置することによって得られる。
一般に、良質の電子顕微鏡写真は、整然とした、明瞭で、全体的に灰色がかった画像として現れる。良好に調製された標本では、膜間の空間は粒状物質で満たされるべきであり、空であってはならない。同様に、細胞内の基底物質または細胞小器官の中に空のスペースが見つからないようにします (図1aと図2aを図3および図4と比較してください)。それにもかかわらず、非常に若い動物の中枢神経系は、成体の脳と比較したときの細胞外空間の拡大のある程度を示しており、細胞間のより緩やかな接続と全.......
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ディスカッション
TEM のための試料調製中の組織切片の処理は、かなりの程度の技巧、濃度および忍耐を必要とする。マイクロピペットを使用して溶液を添加および除去する場合、試料は表面張力によってピペットチップに吸入される可能性があるので、ピペットによる組織損傷を避けるために細心の注意が必要である。また、脱水シーケンスの特定のステップは、1分として迅速であることができるので、オペレータは、次の脱水ステップが時間通りに開始され、検体が乾燥またはしわにならないことを確実にするために迅速に作業する必要があります。特別な注意を必要とする1つの手順は、オスミウムとの事後固定です。セクションは、オスミウムでの処理後に硬くなり、容易に損傷することができます。オスミウムを追加する前に、セクションがバイアルの底部に平坦化されることが不可欠であり、他の任意の折り目は、組織の骨折をもたらすでしょう。Osmicated のティッシュの処理は平らな埋め込みのための aclar のフィルムにセクションを移すとき特に挑戦的である。断片化を避けるために、バイアルの底から試料を持ち上げるときや、フィルムサンドイッチから気泡を押し出すときには、特別な注意が必要です。閉じ込められた空気を押し出すこ.......
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開示事項
作者は何も開示することはありません。
謝辞
この原稿は、NIH/NIGMS K08 123321 (to N.L.) とバージニア大学麻酔科からの資金によって支えられました。研究者は Erisir (Alev、バージニア大学、シャーロッツビル、VA) に感謝し、TEM での優れたトレーニングと技術支援のために、そして、彼女の貴重な原稿批評のためにありがとうと思っています。また、バージニア大学の高度電子顕微鏡検査施設では、検体の断面化と染色後の技術支援にも感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4% 四酸化オスミウム | 電子顕微鏡科学 | 19170 | 水性 |
| 50% グルタルアルデヒド | 電子顕微鏡科学 | 16310 | EM グレード、水性 |
| Aclar 33 C 埋め込みフィルム | 電子顕微鏡科学 | 50425-25 | 7.8 ミル 厚さ、サイズ 8 インチ x 10 |
| インチ BEEM カプセルホルダー | 電子顕微鏡科学 | 69916 | 保持サイズ「00」カプセル |
| BEEM埋め込みカプセル | 電子顕微鏡科学 | 70021 | 「サイズ00、フラット(カットボトム)」 |
| バトラーブロックトリマー | 電子顕微鏡科学 | 69945-01 | |
| キャメルヘアペイントブラシ | 電子顕微鏡科学 | 65576-01 | |
| ディスクパンチ | 電子顕微鏡科学 | 77850-09 | |
| 812キットを埋め込む | 電子顕微鏡科学 | 14120 | |
| 酢酸鉛 | 電子顕微鏡科学 | 17600 | |
| クエン酸鉛 | 電子顕微鏡科学 | 17800 | |
| 硝酸鉛 | 電子顕微鏡科学 | 17900 | |
| ライカUC7ウルトラカットミクロトーム | ライカ | ||
| マイクロスケール | 電子顕微鏡科学 | 62091-23 | |
| パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡科学 | 19208 | EMグレード、粒状 |
| 精密 Thelco 実験オーブン | Thelco | 51221159 | |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark ペン | 電子顕微鏡科学 | 72109-01 | |
| チロード溶液 | 電子顕微鏡科学 | 11760-05 | |
| 酸ウラニル | 電子顕微鏡科学 | 22400 | 粉末 |
参考文献
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.
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再版と許可
