Rensning af ekstracellulære vesikulære præparater med høj udbytte afstand fra virus

Denne protokol er vigtig, fordi den koncentrerer ekstracellulære vesikler, elbiler, gennem en kombination af teknologier, samtidig med at der er mulighed for adskillelse af virioner væk fra elbiler. Denne metode maksimerer EV opsving over den nuværende guld standard for ultracentrifugering for flere downstream analyse og karakterisering af virus-fri EV preps. Denne protokol er ideel til undersøgelse af EV’s og virusinfektioner.

Denne metode kan tilpasses andre virussystemer, såsom HTLV, Ebola, Zika og meget mere. Jeg forventer en første gang bruger af denne metode til at kæmpe med nanopartikel forberedelse, så vi anbefaler omhyggeligt at følge vores specifikationer. Nogle optimering kan være nødvendig, afhængigt af systemet.

Visuel demonstration af denne metode er vigtig for at illustrere det overordnede arbejdsflow og nuancerne i protokollen, hvilket vil reducere tid og fejl for første gangsbrugere. Start med at forberede kultur supernatant fra inficerede eller transfekterede celler. Kultur ca. 10 milliliter sene logceller i fem dage ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, og sørg for, at alle medium reagenser er fri for ekstracellulære vesikler.

Når kulturen er klar, pellet cellerne ved centrifugering på 3, 000 gange G i fem minutter og kassér pellet. Supernatanten filtreres med et sterilt 0,22 mikrometerfilter, og filtratet opsamls i et rent rør. Tilsæt en tilsvarende mængde PEG nedbør reagenser til filtrat, og invertere røret flere gange for at blande.

Inkuber blandingen ved fire grader Celsius natten over. Efter inkubationen centrifugeres blandingen ved 1500 gange G i 30 minutter for at give en heterogen ekstracellulær vesicle eller EV-pellet. Kassér supernatanten, og suspension pellet i 150 til 300 mikroliter af 1X PBS, uden calcium og magnesium.

Hold pellet på is, mens du forbereder en tæthed gradient. Forbered iodixanoltæthed gradient medium med 11 densitet fraktioner, der spænder fra seks til 18% iodixanol, som beskrevet i manuskriptet. Bland hvert rør ved at vortexing og lag densitet fraktioner i en ren og tør svingende spand ultracentrifuge rør.

Tilsæt den re-suspenderet EV pellet til toppen af lagdelte gradient og ultracentrifuge røret ved 10, 000 gange G, og fire grader Celsius i 90 minutter. Overfør forsigtigt hver fraktion fra ultracentrifugerøret til et nyt mikrocentrifugerør. Der forbered en 30% gylle af nanopartikler til EV-fraktionsberigelse ved at blande lige store mængder NT80, NT82 og 1X-PBS.

Vortex nanopartikelblandingen for at sikre homogenitet. Der tilsættes 30 mikroliter af gyllen til hver massetæthedsfraktion, og der blandes enten ved at røre eller vende rørene. Det mest kritiske skridt er tilføjelsen af nano-artikler til at koncentrere EV’s, efter densitet gradient adskillelse.

Uden dette, ev opsving er dårlig. Drej nanopartikel, der indeholder tæthed fraktioner natten over, ved fire grader Celsius. Derefter centrifuge densitet fraktioner på 20, 000 gange G i fem minutter ved stuetemperatur.

Kassér væsken og vask EV-pellets to gange med 1X-PBS. For at forberede pellet til RNA isolation, re-suspendere det 50 mikroliter af autoklavede, deioniseret vand, filtreret og behandlet med depsi, i henhold til manuskriptet retninger. RNA kan derefter isoleres ved hjælp af et kommercielt kit.

Til analyse med gelelektrophoresis skal pelleten igen suspenderes i 15 mikroliter af Laemmli-buffer. Varm prøven til 95 grader Celsius i tre minutter. Gentag opvarmningstrinnet to gange mere, vortexing forsigtigt og spinding prøven ned mellem varme cykler.

Centrifuge prøven i 15 sekunder ved 20,000 gange G, og læg supernatanten direkte på gelen. For de bedste resultater, begrænse mængden af partikler lastet på gelen, og køre det på 100 volt, for at forhindre eventuelle lastede nanopartikler i at komme ind i gelen. PEG nedbør giver mulighed for betydeligt mere effektiv EV opsving, end traditionelle ultracentrifugering.

Når du bruger 10 milliliter kultur, denne fremgangsmåde resulterer i en ca 500 gange højere udbytte end ultracentrifugering. Denne tilgang resulterer også i en øget isolationseffektivitet af exosomer, hvilket er tydeligt gennem højere niveauer af exosome markør proteiner. Western PLA analyse viser, en 3000 fold stigning i CD81, en fire gange stigning i CD63 og en 40 gange stigning i CD9.

Desuden giver denne protokol mulighed for downstream-undersøgelser af EV medieret mekanismer i HIV1-infektion, ved at isolere EV’s fra verions. Western PLA analyse viser, at EV’s findes i tre fraktioner populationer. Mens virus er til stede i kun to af dem.

EV’s overtrædelse 10,8 til 12 er fri for virusforurening. Det vigtigste at huske er, at nanopartiklerne er afgørende for optimal EV-berigelse. Deres tilføjelse er et must.

Mange downstream-analyser, såsom western blot, PCR, ren diomech analyse ved massespektrometri i pladebaserede cellulære analyser kan udføres. Disse giver mulighed for karakterisering, mekanistiske og / eller funktionelle undersøgelser. Denne teknik giver mulighed for specifikke undersøgelser, der undersøger EV last og funktionalitet uden at forurene viral baggrund.

Dette giver et grundlag for at studere EV’s i patogenese og udvikling af potentielle terapeutiske. For at overvinde begrænsningerne i denne teknik, og for at anvende EV forberedelse og isolering til store mængder, anbefaler vi brug af avancerede systemer, såsom tangential flow filtrering. Det farligste instrument, der skal anvendes, er ultracentrifuge under tæthedens gradientadskillelse.

Sørg for, at alle centrifugerør vejer ens for at undgå ubalance og potentiel rotorsvigt.