Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Dit protocol is belangrijk omdat het extracellulaire vikjes, EV’s, door een combinatie van technologieën concentreert, terwijl het mogelijk maakt voor scheiding van virions uit de buurt van EV’s. Deze methode maximaliseert EV herstel boven de huidige gouden standaard van ultracentrifugatie voor meerdere downstream analyse en karakterisering van virus-vrije EV preps. Dit protocol is ideaal voor de studie van EV’s en virale infecties.

Deze methode kan worden aangepast aan andere virussystemen, zoals HTLV, Ebola, Zika en meer. Ik zou verwachten dat een eerste keer gebruiker van deze methode te worstelen met nanodeeltjes voorbereiding, dus we raden zorgvuldig na onze specificaties. Afhankelijk van het systeem kan enige optimalisatie nodig zijn.

Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk voor het illustreren van de algehele werkstroom en nuances van het protocol, die tijd en fouten voor de eerste keer gebruikers zal verminderen. Begin met het voorbereiden van cultuur supernatant van geïnfecteerde of transfected cellen. Kweek ongeveer 10 milliliter late blokcellen gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, om ervoor te zorgen dat alle middelgrote reagentia vrij zijn van extracellulaire vesicles.

Wanneer de cultuur klaar is, pellet de cellen door centrifugatie op 3,000 keer G gedurende vijf minuten en gooi de pellet. Filtreer de supernatant met een steriel 0,22 micrometerfilter en verzamel het filtraat in een schone buis. Voeg een gelijk volume peg-neerslagreagentia toe aan het filtraat en keer de buis meerdere keren om te mengen.

Incubeer het mengsel op vier graden Celsius ‘s nachts. Na de incubatie, centrifugeren het mengsel op 1500 keer G gedurende 30 minuten, om een heterogene extracellulaire blaasje, of EV, pellet opleveren. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 150 tot 300 microliter 1X PBS, zonder calcium en magnesium.

Houd de pellet op ijs, terwijl de voorbereiding van een dichtheid gradiënt. Bereid het iodixanol dichtheidsgradiëntmedium voor met 11 dichtheidsfracties, variërend van zes tot 18%iodixanol, zoals beschreven in het manuscript. Meng elke buis door vortexing en laag de dichtheid fracties in een schone en droge swingende emmer ultracentrifuge buis.

Voeg de opnieuw opgehangen EV-pellet toe aan de bovenkant van het gelaagde verloop en ultracentrifuge de buis op 10, 000 keer G en vier graden Celsius gedurende 90 minuten. Breng elke fractie voorzichtig over van de ultracentrifugebuis naar een nieuwe microcentrifugebuis. Bereid een 30% drijfmest van nanodeeltjes voor EV-fractieverrijking, door gelijke volumes van NT80, NT82 en 1X-PBS te mengen.

Vortex het nanodeeltjesmengsel om homogeniteit te garanderen. Voeg 30 microliter van de drijfmest toe aan elke dichtheidsfractie en meng door de buizen te pipetten of om te keren. De meest kritische stap is de toevoeging van de nano-artikelen om EV’s te concentreren, na de dichtheid gradiënt scheiding.

Zonder dit, EV herstel is slecht. Draai het nanodeeltje met dichtheidsfracties ‘s nachts, op vier graden Celsius. Dan centrifugeren de dichtheid fracties op 20,000 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Gooi de vloeistof weg en was de EV pellet twee keer met 1X-PBS. Om de pellet voor te bereiden op RNA isolatie, opnieuw op te schorten 50 microliters van autoclaved, gedeïoniseerd water, gefilterd en behandeld met depsie, volgens het manuscript richtingen. Het RNA kan dan worden geïsoleerd, met behulp van een commerciële kit.

Voor analyse met gel elektroforese, opnieuw opschorten de pellet in 15 microliters van Laemmli buffer. Verwarm het monster gedurende drie minuten op 95 graden Celsius. Herhaal de verwarming stap twee keer, vortexing zachtjes en spinnen het monster naar beneden tussen de warmte cycli.

Centrifugeren het monster gedurende 15 seconden op 20.000 keer G en laad het supernatant direct op de gel. Voor de beste resultaten, beperk de hoeveelheid deeltjes geladen op de gel, en voer het op 100 volt, om te voorkomen dat geladen nanodeeltjes van het invoeren van de gel. PEG neerslag zorgt voor aanzienlijk efficiënter EV herstel, dan traditionele ultracentrifugatie.

Bij het gebruik van 10 milliliter cultuur resulteert deze aanpak in een ongeveer 500 keer hogere opbrengst dan ultracentrifugatie. Deze aanpak resulteert ook in een verhoogde isolatie-efficiëntie van exosomen, wat duidelijk is door hogere niveaus van exosoom marker eiwitten. Western PLA analyse toont aan, een 3000 keer de stijging van cd81, een viervoudige toename van CD63 en een 40-voudige toename van CD9.

Bovendien, dit protocol maakt het mogelijk voor downstream-studies van EV gemedieerde mechanismen in HIV1-infectie, door het isoleren van EV’s van verions. Westerse PLA analyse toont aan dat EV’s zijn te vinden in drie fractie populaties. Terwijl het virus aanwezig is in slechts twee van hen.

EV’s overtreding 10,8 tot en met 12 zijn vrij van virusbesmetting. Het belangrijkste om te onthouden is dat de nanodeeltjes cruciaal zijn voor een optimale EV-verrijking. Hun toevoeging is een must.

Veel downstream tests, zoals western blot, PCR, pure diomech analyse door massaspectrometrie in plaat-gebaseerde cellulaire testen kunnen worden uitgevoerd. Deze zorgen voor karakterisering, mechanistische en/of functionele studies. Deze techniek maakt specifieke studies mogelijk die EV-lading en -functionaliteit onderzoeken zonder virale achtergrond te besmetten.

Dit biedt een basis voor het bestuderen van EV’s in pathogenese en de ontwikkeling van potentiële therapieën. Om de beperkingen van deze techniek te overwinnen en EV-voorbereiding en isolatie toe te passen op grote volumes, raden we het gebruik van geavanceerde systemen aan, zoals tangentiale stroomfiltratie. Het gevaarlijkste te gebruiken instrument is de ultracentrifuge, tijdens de dichtheidsgradiëntscheiding.

Zorg ervoor dat alle centrifugebuizen hetzelfde gewicht, om onbalans en potentiële rotor falen te voorkomen.