Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie

Dit protocol wordt gebruikt voor de detectie van kritisch informatieve genfusies voor tumormonsters van patiënten. De fusiestatus van tientallen genen wordt gelijktijdig in één test beoordeeld. Het voordeel van deze techniek is dat ik genfusies kan identificeren, ongeacht de identiteit van de fusiepartner van tumormonsters die zijn verwerkt door middel van formuleveformatie.

De detectie van bepaalde genfusie in klinisch tumormonster informeert direct de diagnose, prognose en behandelingsselectie bij veel kankertypen. Het is van cruciaal belang om te begrijpen dat veel fusies genoemd door de analyse algoritme zijn artefacten. De moeilijkste taak bij het analyseren van gegevens is het onderscheid maken tussen artefact en echte fusiegesprekken.

Begin met het verdunnen van het totale nucleïnezuur om de gewenste concentratie RNA te bereiken. Voor elk monster, breng 20 microliter van de verdunning in de willekeurige priming reagent strip buizen in een voorgekoeld aluminium blok en meng door pipetting op en neer zes tot acht keer. Draai de monsters kort naar beneden, breng het hele volume over naar een 96-put PCR-plaat en sluit af met plaatverzegelerfolie.

Steek de plaat in een thermocycler, dek af met het compressiekussen en sluit het deksel. Incubeer op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten. Breng na de incubatie het volledige volume van het willekeurige primingproduct over in de eerste strengreagenstripbuizen.

Meng door pipetting op en neer en kort spin naar beneden. Breng het volledige volume over naar een 96-put PCR-plaat en verzegel met RT-film. Plaats de plaat in de thermocycler en voer de reactie uit volgens de handschriftrichtingen.

Voer tweede streng cDNA synthese, en reparatie, en ligatie stap een volgens het manuscript richtingen en ga naar de tweede ligatie stap. Als u de moleculaire barcode of MBC-adapterstripbuizen wilt nummeren, plaatst u de buizen horizontaal met scharnieren aan de achterkant en gebruikt u een permanente markering. Neem de kraalzuiveringsplaat van de eerste ligatiestap en breng 40 microliter van elk monster over in de MBC-adapterstripbuizen, waarbij u ervoor zorgt dat de kraalpel niet wordt verstoord.

Meng de reagentia door pipetting, spin vaststelling van de buizen, en breng het hele volume naar de ligatie stap twee reagens strip buizen. Meng de monsters, draai ze naar beneden, en plaats in een thermocycler blok. Laat het verwarmde deksel eraf en laat de thermocycler vijf minuten op 22 graden Celsius draaien, gevolgd door 4 graden Celsius.

Bereid vervolgens de ligatie opruimen kralen door vortexing hen en het toevoegen van 50 microliters aan een nieuwe set van PCR strip buizen. Broed een minuut op de magneet en gooi de supernatant weg. Verwijder de stripbuizen van de magneet en zet de kralen opnieuw op in 50 microliters van ligatieopruimbuffer door op en neer te pipetten.

Breng het volledige monstervolume van de tweede ligatiestap over in de ligatieopruimingsstrook. Vortex de monsters te mengen en laat ze op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Vortex het monster een keer halverwege de incubatie.

Daarna, vortex de monsters, draai ze naar beneden, en uitbroeden op de magneet voor een minuut. Gooi de supernatant weg en voeg 200 microliters verse ligatieopruimbuffer toe. Vortex te resuspend, spin down, en plaats op de magneet voor een minuut.

Na de twee wasbeurten, voer een derde wassen met behulp van ultrazuiver water in plaats van buffer. Resuspend de kralen in 20 microliter van 5 millimeter natriumhydroxide en breng de monsters naar een 96-well PCR plaat. Plaats de plaat in een thermocycler met een compressiepad en voer deze 10 minuten op 75 graden Celsius, gevolgd door een 4 graden Celsius.Place the plate into a thermocycler with a compression pad and run it at 75 degrees Celsius for 10 minutes, followed by a 4 degrees Celsius hold.

Zodra de monsters zijn afgekoeld tot 4 graden Celsius, plaats de plaat op een magneet gedurende ten minste drie minuten en ga verder met de eerste PCR. Bereid de PCR-reacties voor door twee microliter GSP1-primers toe te voegen aan elke put van de eerste PCR-reagenstrip. Breng 18 microliters van het tweede ligatieopruimproduct over naar de eerste PCR reagens stripbuizen en meng door op en neer te pipetten.

Draai de monsters en breng ze naar een 96-well PCR plaat. Plaats ze in de thermocycler en voer PCR volgens het manuscript richtingen. Ga verder met kraalzuivering door 20 microliters van het PCR-product toe te voegen aan een U-bodemplaat gevuld met 24 microliter zuiveringskralen per put.

Pipette op en neer om te mengen en laat de plaat op kamertemperatuur gedurende vijf minuten, dan incubeer de plaat op de magneet gedurende twee minuten. Gooi de supernantant uit de kralen en was ze twee keer met 200 microliter van 70% ethanol. Verwijder na de laatste wasbeurt alle ethanol en laat het monster twee minuten drogen.

Haal de plaat van de magneet en zet de kralen opnieuw in 24 microliter van 10 millimeter Tris-HCl en pH 8.0. Incubeer de magneet gedurende drie minuten uit en plaats de plaat vervolgens twee minuten terug op de magneet. Begin met de kwantificering van de bibliotheek door één tot vijf verdunningen van het tweede PCR-product in 10 millimeter Tris-HCl voor te bereiden.

Volg dit door een seriële verdunning van 1:199, 1:199 en 20:80 in 10 millimeter Tris-HCl met 05% polysorbate. Stel key PCR op door zes microliters van master mix toe te voegen aan elke put van een optische 96-put plaat, gevolgd door vier microliters van de juiste verdunning of standaard. Draai de plaat naar beneden en laad deze in het qPCR-instrument.

Voer qPCR uit volgens de aanwijzingen van het manuscript. Nadat de bibliotheekkwantificering is voltooid, verdun alle bibliotheken tot twee nanomolar met 10 millimeter Tris-HCl. Maak een bibliotheek zwembad door het combineren van 10 microliters van elke genormaliseerde bibliotheek in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.

Bereid vervolgens de gedenatureerde ampliconbibliotheek, of DAL-zwembad, door 10 microliters van het bibliotheekzwembad te combineren met 10 microliters van 0,2 normaal natriumhydroxide en het mengsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur uit te broeden. Voeg na de incubatie 10 microliter van 200 millimeter Tris-HCl toe bij pH 7.0, gevolgd door 970 microliters HT1 Hybridization Buffer. Maak de laatste belastingbuis door 300 microliter HT1, 25 microliter van 20 picomolar PhiX en 675 microliters van de DAL-pool te combineren.

Voeg het volledige volume van de laadbuis toe aan de monsterput van de sequencerreagetcartridge en laad de cartridge in de sequencer. Begin met het selecteren van het positieve controlemonster en zorg ervoor dat alle verwachte fusies en oncogene isovormen zijn gedetecteerd en worden vermeld op het tabblad sterk bewijs. Inspecteer voor elk voorbeeld de gemiddelde unieke startsites per GSP2-controlewaarde en visualiseer vervolgens de ondersteunende reads voor elke potentiële fusie door op de koppeling Visualiseren te klikken die de gebruiker naar een webgebaseerde JBrowse-weergave van opstapelingen van afzonderlijke fusieondersteunende leest brengt.

Bevestig dat de reads meestal vrij zijn van mismatch, maar meer dan 30 basissen van de reads komen overeen met de fusiepartner en dat sequenties naast het breekpunt tussen de genen en primerbindingsplaatsen vrij zijn van invoegingen of verwijderingen. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat elke gespreksfusie over het algemeen vrij is van verkeerde uitlijning en dat een aanzienlijk deel van de reads zich aan de fusiepartner richt. Dit protocol is gebruikt om de genfusiestatus in een longadenocarcinoommonster te onderzoeken.

De samenvatting toont sterke bewijsfusies en de pagina Statistieken lezen toont statistieken van de steekproef. Dit voorbeeld vertoont een goede RNA-kwaliteit, zodat negatieve resultaten zouden worden gerapporteerd als er geen fusies werden gevonden. Een legitieme fusie oproep heeft een groot aantal ondersteunende leest, een hoog percentage van de leest van de primer ter ondersteuning van de fusie, en een groot aantal startlocaties.

Visualisatie van de reads toont een goede afstemming aan grote regio’s van de fusiepartner. Omgekeerd heeft een artefactuele fusieoproep lagere ondersteunende statistieken en een hoog foutenpercentage bij het toewijzen aan de partner. Artefactuele fusie gesprekken gemaakt door de analyse algoritme zijn gemeenschappelijk.

Het is van cruciaal belang om elke oproep handmatig te inspecteren om ervoor te zorgen dat het een echte genfusie in het patiëntenmonster vertegenwoordigt.