来自胚胎GFP-表达小鼠的Ex Vivo Oculo运动切片培养,用于对Oculo运动神经外生长进行时移成像

该协议使我们能够识别在奥库洛运动神经中活跃的轴顿制导通路，并实时评估它们在神经轨迹的不同点的作用。此技术保留了轴子旅行的本地环境及其最终目标。生长的轴子不切割，因此可以评估初始轴子的生成，而不是再生。

该方法提供了对眼动系统中轴孔制导的见解，但可以适应其他神经轴翁制导的研究。这种技术需要实践来掌握，快速工作是非常重要的。第一次尝试时，只使用几个胚胎，而不是整个垃圾。

在开始手术之前，首先在胚胎10.5的胚胎日通过超声波确认妊娠的时分交配。收获胚胎，用70%乙醇喷洒怀孕小鼠的腹部，用剪刀打开腹腔提取子宫。在将器官放入新鲜冰冷HSS的第二个培养皿中之前，将子宫用冰冷的HS培养皿中清洗子宫。

在解剖范围内，从子宫角及其单个羊膜囊中去除胚胎，将每个胚胎放在12井板盖的底面，在收获时放在冰上。使用滤纸去除每个胚胎周围的任何液体，而不接触胚胎本身，将胚胎淹没在液体中4%的低熔化糖。将板盖放在冰上，以凝固加糖。

当阿加罗斯变硬时，翻转胚胎，用额外的阿加罗斯覆盖每个样品的另一侧。当第二卷阿加罗斯凝固后，使用荧光解剖显微镜修剪每个胚胎周围的阿加罗斯，使每个胚胎在振动体阶段正确定向。胶体运动核和早期轴龙生长应该是荧光的。

对齐每个胚胎，使核，外生长的轴子，和眼睛形成一条线，并使用剃刀刀片修剪与这条线平行的红糖。接下来，用冰冷的切片缓冲液填充振动室，将第一个胚胎超粘到振动体阶段，使叶片与眼核和眼睛平行。当超级胶水干燥时，将振动体阶段淹没，使胚胎朝向远离刀片，并使用新的振动体刀片获得 400 到 450 微米切片。

使用无菌转移移液器将每片在获得时转移到冷切片缓冲液中，并使用荧光解剖显微镜选择含有眼细胞核和眼睛的切片。使用无菌转移移液器，将切片转移到六井板中的细胞培养物中，每井含有1.5毫升培养介质，并将该切片放在37摄氏度的培养箱中。从振动体阶段去除残留的阿加罗斯，将下一个胚胎超粘到舞台上，继续收集切片，直到所有胚胎被切开并镀上。

然后将感兴趣的抑制剂或重组分子的适当浓度添加到每个井的介质中，用适当的溶剂稀释。创建剂量-响应曲线。每 30 分钟通过相位对比度和荧光显微镜对切片进行一次图像，长达 72 小时。

在子宫发育的正常情况下，第一个绿色荧光蛋白阳性的细胞运动轴子在胚胎第11.5天到达轨道，然后分支到其最终目标，如在这个代表性的切片培养中观察到的。振动器舞台上切片的方向至关重要，因为如果切片方向不正确，则无法解释。例如，如果胚胎向其侧倾斜，则切片内只能观察到一个细胞运动核。

如果嵌入的胚胎向背部倾斜太远，则眼睛将不在切片内，相反，可能会包括上肢、后脑或脊髓。同样重要的是，在将切片放置在培养膜上时，组织不会折叠。溶解有机溶剂中的抑制剂和生长因子时小心。

例如，在这个实验中，该片在将乙醇添加到介质中后死亡。请记住，应将所有内容放在冰上，并尽量减少提取胚胎和将切片放入培养箱之间的时间。利用这项技术，我们已经开始识别在眼动系统中起作用的其他轴孔制导机制。

使用剃须刀刀片时，请小心谨慎，某些抑制剂可能很危险，应根据其安全配置文件小心处理。