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July 16, 2019
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यह प्रोटोकॉल हमें ऑकुलोमोटोर तंत्रिका में सक्रिय अक्षतं मार्गदर्शन मार्गों की पहचान करने और वास्तविक समय में तंत्रिका प्रक्षेपवक्र के साथ विभिन्न बिंदुओं पर उनकी भूमिकाओं का आकलन करने की अनुमति देता है। यह तकनीक स्थानीय वातावरण को बरकरार रखता है जिसके माध्यम से अक्षों यात्रा और उनके अंतिम लक्ष्य। बढ़ते अक्षतंवर में कटौती नहीं की जाती है, इसलिए प्रारंभिक अक्षतंवर वृद्धि, पुनर्जनन के बजाय, मूल्यांकन किया जा सकता है।
यह विधि नेत्र मोटर प्रणाली में एक्सोन मार्गदर्शन में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है लेकिन अन्य नसों के अक्षति मार्गदर्शन के अध्ययन के लिए अनुकूलित की जा सकती है। इस तकनीक में महारत हासिल करने के लिए अभ्यास लेता है, और जल्दी से काम करना बेहद महत्वपूर्ण है। जब यह पहली बार के लिए कोशिश कर रहा है, बस कुछ भ्रूण का उपयोग करें, बजाय एक पूरे कूड़े ।
प्रक्रिया शुरू करने से पहले, पहले एक समय पर संभोग से भ्रूण दिवस 10.5 पर अल्ट्रासाउंड द्वारा गर्भावस्था की पुष्टि करें। भ्रूण को फसल दें, गर्भवती माउस के पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें, और गर्भाशय निकालने के लिए पेट की गुहा को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें। गर्भाशय को बर्फ से ठंडे एचबीएसएस की पेट्री डिश में धोएं ताजे बर्फ से ठंडे एचबीएसएस की दूसरी पेट्री डिश में अंग रखने से पहले।
एक विच्छेदन दायरे के तहत, गर्भाशय सींग और उनके व्यक्तिगत एमनियोटिक सैक्स से भ्रूण को हटा दें, प्रत्येक भ्रूण को 12-अच्छी प्लेट के ढक्कन के नीचे, बर्फ पर रखें, क्योंकि उन्हें काटा जाता है। प्रत्येक भ्रूण के आसपास के किसी भी तरल को हटाने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें, भ्रूण को छूने के बिना, और तरल 4% कम पिघलने वाले एगर उठे में भ्रूण को जलमग्न करें। एगर उठे को जमना करने के लिए प्लेट के ढक्कन को बर्फ पर रखें।
जब agarose कठोर है, भ्रूण पर फ्लिप और अतिरिक्त agarose के साथ प्रत्येक नमूने के दूसरे पक्ष को कवर । जब एगर उठे की दूसरी मात्रा जम जाती है, तो प्रत्येक भ्रूण के चारों ओर उत्प्रजित को ट्रिम करने के लिए माइक्रोस्कोप को विच्छेदन करने के लिए फ्लोरेसेंस विच्छेदन का उपयोग करें ताकि प्रत्येक भ्रूण वाइब्रेटोम चरण पर ठीक से उन्मुख हो जाए। ऑकुलोमोटर नाभिक और प्रारंभिक अक्षों की वृद्धि फ्लोरोसेंट होनी चाहिए।
प्रत्येक भ्रूण को संरेखित करें ताकि नाभिक, एक्सॉन को आगे बढ़ें, और आंख एक रेखा बनाएं, और इस रेखा के समानांतर उत्पन्न को ट्रिम करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। इसके बाद, वाइब्रेटम चैंबर को बर्फ-ठंडे स्लाइस बफर के साथ भरें, और वाइब्रेटोम चरण के पहले भ्रूण को सुपरग्लू करें ताकि ब्लेड ओकुलोमोटर नाभिक और आंखों के समानांतर हो जाए। जब सुपरग्लू सूखी होती है, तो वाइब्रेको चरण को जलमग्न कर दें ताकि भ्रूण ब्लेड से दूर हो जाए, और 400-से 450-माइक्रोमीटर स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक नए वाइब्रेकोम ब्लेड का उपयोग करें।
प्रत्येक स्लाइस को ठंडे स्लाइसिंग बफर में स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें क्योंकि यह अधिग्रहीत किया जाता है, और ओकुलोमोटर नाभिक और आंखों वाले स्लाइस का चयन करने के लिए फ्लोरेसेंस विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, एक सेल संस्कृति पर टुकड़ा हस्तांतरण एक छह अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के १.५ मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से युक्त थाली में डालने, और एक ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह है । वाइब्रेकोम चरण से अवशिष्ट agarose निकालें, और मंच पर अगले भ्रूण superglue, जब तक भ्रूण के सभी sectioned और चढ़ाया गया है स्लाइस इकट्ठा करने के लिए जारी है ।
फिर प्रत्येक कुएं के माध्यम में, एक उपयुक्त विलायक में पतला, ब्याज के अवरोधक या पुनः संयोजन अणु की उचित एकाग्रता जोड़ें। एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र बनाएं। 72 घंटे तक चरण विपरीत और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा स्लाइस हर 30 मिनट छवि।
गर्भाशय विकास में सामान्य के दौरान, पहले हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन-पॉजिटिव ऑकुलोमोटर एक्सॉन अपने अंतिम लक्ष्यों को शाखाओं में रखने से पहले भ्रूणीय दिन 11.5 द्वारा कक्षा तक पहुंचते हैं, जैसा कि इस प्रतिनिधि स्लाइस संस्कृति में देखा गया है। वाइब्रेकोम चरण पर स्लाइस का अभिविन्यास महत्वपूर्ण है, क्योंकि स्लाइस व्याख्या योग्य नहीं हैं यदि वे ठीक से उन्मुख नहीं हैं। उदाहरण के लिए, यदि भ्रूण अपनी तरफ झुका हुआ है, तो स्लाइस के भीतर केवल एक ऑकुलोमोटर नाभिक देखा जाएगा।
यदि एम्बेडेड भ्रूण अपनी पीठ की ओर बहुत दूर झुका हुआ है, तो आंखें स्लाइस के भीतर मौजूद नहीं होंगी, और इसके बजाय ऊपरी अंग और हिंडब्रेन या रीढ़ की हड्डी को शामिल किया जा सकता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि संस्कृति झिल्ली पर टुकड़ा के प्लेसमेंट के दौरान, कि ऊतक मुड़ा नहीं जाता है। कार्बनिक सॉल्वैंट्स में अवरोधकों और विकास कारकों को भंग करते समय ध्यान रखें।
उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में, माध्यम में इथेनॉल के अलावा टुकड़ा मर गया। बर्फ पर सब कुछ रखने के लिए और भ्रूण की निकासी और इनक्यूबेटर में स्लाइस रखने के बीच समय को कम करने के लिए याद रखें । इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने नेत्र मोटर प्रणाली में काम पर अतिरिक्त एक्सॉन मार्गदर्शन तंत्र की पहचान करना शुरू कर दिया है।
रेजर ब्लेड के साथ काम करते समय सावधानी का उपयोग करना याद रखें और कुछ अवरोधक खतरनाक हो सकते हैं और उन्हें उनकी सुरक्षा प्रोफाइल के अनुसार सावधानी से संभाला जाना चाहिए।
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एक पूर्व विवो टुकड़ा परख oculomotor तंत्रिका वृद्धि वास्तविक समय में छवि की जा करने के लिए अनुमति देता है। स्लाइस e10.5 IslMN embedding द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं: agarose में GFP भ्रूण, एक vibratome पर टुकड़ा, और एक मंच शीर्ष इनक्यूबेटर में बढ़ रही है. एक्सॉन मार्गदर्शन रास्ते की भूमिका संस्कृति मीडिया के लिए inhibitors जोड़कर मूल्यांकन किया है.
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Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).
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