Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generation av Chimeric Axolotls med Mutant Haploid lemmar genom embryonala Ympning
Chapters
Summary January 29th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta mål med detta protokoll är att producera chimära axolotls med haploida framben som härrör från Cas9-mutagena givare vävnad med embryonalvävnad ympning tekniker.
Transcript
Detta protokoll tillåter produktion av mutagenized haploid lemmar som kan användas för genetisk screening i axolotl. I haploider, även låg nivå mutagenesis kan producera förlust av funktion fenotyper inom celler. Denna ympningsteknik kan också användas för att rädda embryonala dödliga fenotyper.
Denna metod kan användas för att studera regenerering i någon amfibieart som är mottaglig för in vitro-befruktning och ympning. Innan du använder haploid embryon som givare, rekommenderar vi att öva och bekräfta framgången för ympkvistar mellan GFP positiva och negativa diploid embryon. För kvinnliga gamete givaren förberedelse, bedöva en sexuellt mogen vit eller vit RFP kvinnliga axolotl att fungera som gamete givaren.
Efter att ha bekräftat en brist på svar på smärta simulering, använd en 30 gauge insulin spruta för att injicera 0,15 milliliter av mänskliga korion gonadotropin i muskulatur dorsala till bakbenen. Sätt in sprutan i 45 graders vinkel mot mittlinjen för att undvika kontakt med ryggmärgen. Placera det injicerade djuret i färsk 40%Holtfreters lösning och överför axolotlen till ett åtta till 12 graders Celsius kylskåp i 48 timmar.
Sedan tillbaka honan till rumstemperatur. Medan honan lägger ägg, placera en helt sövd hane i ryggläge på fuktiga pappershanddukar under ett dissekerande mikroskop och placera spetsen på en P1000-pipett vid basen av kloaka med den dominerande handen. Placera den andra pekfingret och tummen två till tre centimeter rostral till bäckenet och försiktigt pressa djuret samtidigt som fingrarna mot bakbenen för att spola ut de spermiska urinproven samla varje prov i en ny mikrocentrifug röret.
Överför sedan fem mikroliter från varje prov till en petriskål för att inspektera spermiernas kvalitet med hjälp av ett inverterat mikroskop. Efter räkning, späd sperma till en koncentration av åtta gånger 10 till fjärde celler per milliliter i 0.1X steril MMR och överföra 0,5 mikroliter av spermier per ägg till en ny Petriskål. Använd sedan pipettspetsen för att sprida fjädringen till ett en millimeter tjockt lager och använd en plastlyft för att placera provet fyra centimeter från lökarna på en 254 nanometer crosslinker för bestrålning vid åtta gånger 10 till de femte mikrojoule per millimeter i kvadrat.
Efter att ha samlat ett friskt spermieprov, placera honan i ryggläge på en bunt fuktiga pappershanddukar och använd en liknande spolningsrörelse för att extrahera obefruktade ägg från den kvinnliga axolotlen. Använd sedan våta tynor för att överföra äggen till en 10 centimeter Petriskål. Inom 15 minuter efter insamling, använd en P10 pipetter för att fördela den bestrålade spermier på obefruktade ägg beläggning varje ägg med 0,25 till 0,5 mikroliter av inaktiverad spermier.
Efter att äggen har 50 minuter att sitta i rumstemperatur, översvämma äggen med 0,1X MMR. Trettio minuter efter hydrering, använd skarpa tlysrör för att dejelly äggen och placera äggen på 18 grader Celsius för mikroinjektion inom sju timmar. För att generera en haploid-diploid chimär, placera en hälsosam haploid givare med en eller två steg matchade GFP positiva diploida värd embryon inuti tråg av en pre-kyld driftsskålen som innehåller kirurgiska medium på en 10 grader Celsius eller lägre kylning skede.
Använd två ultrafina autoklaverade rak spetstångstånger för att ta bort hela lemknoppen och de omgivande ektoderm- och mesodermvävnadslagren och ställ undan värdvävnaden. Avlägsna en likvärdigt storlek vävnadsslät från haploidgivaren och placera den haploida donatorvävnadssläten på motsvarande region i värdembryot. Säkra vävnaden med en autoklaverad rektangulär glasskärva från ett krossat mikroskop-coverglass och tryck försiktigt in vävnaden i värdembryonskroppen.
Låt ankaret vara på plats i 60 till 75 minuter och kontrollera var 20:e minut för att bekräfta att glaset inte har halkat innan du använder tärnorna för att skala av täckglasfragmentet. Överför de engrafted embryona in i nytt kirurgiskt medel som låter dem läka på åtta till 12 grader Celsius över natten, innan inhysa de engrafted embryona individuellt i 12 eller 24-brunn pläterar. 38,7%av äggceller utvecklats till normalt utvecklade haploid embryon.
På ympkvisten skede, haploid embryon uppvisar en minskad krökning längs den främre-bakre axeln och en ofullständig kapsling av äggula plugg. Dessutom kan ett fluorescerande mikroskop användas för att bekräfta haploid embryon är fria från paternally-härledda GFP uttryck. Misslyckades och orena ympkvistar producerar en mängd olika fenotyper.
När ympkvistarna är rena och normalt utvecklas, bör GFP uttryck begränsas främst till brachialis plexus, det neurala nätverket som härrör från värd ryggmärgen. Punktat GFP uttryck är också närvarande i enstaka celler som verkar vara sensoriska nervceller i blod-derived värdceller som migrerar in i den växande delen. När RFP positiva givare används, haploid graft lemmar uppvisar ett universellt uttryck för RFP.
Under hela utvecklingen, icke-mutagenized haploid lemmar är betydligt kortare än de motsatta diploida framben i chimeric djur. Icke-mutagenized haploid lemmar regenerera helt, även om de visar en liten fördröjning i att nå den digitala utväxten skede jämfört med diploider. Kom ihåg att använda steril teknik och helt ta bort och ersätta hela mesoderm och ektoderm vävnadsskikt från den embryonala värden för att producera en rent ympade lem.
Mutant lemmar kan amputeras och poäng för regenerering fenotyper. Mutant alleler kan kvantifieras med nästa generations sekvensering. I kombination med CRISPR-Cas9 mutagenesis har vår ympningsteknik gjort det möjligt för oss att genomföra en negativ urvalsskärm av riktade gener i regenererande haploida lemmar.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.