Bioengineering
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使用光声流细胞测定卵巢癌检测
Chapters
Summary January 17th, 2020
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提出了利用定制的光声流系统和靶向叶酸封铜硫化纳米粒子检测循环卵巢肿瘤细胞的协议。
Transcript
目前临床卵巢癌检测措施为循环肿瘤细胞非特异性和缺乏护理点检测。我们的光音流系统能够测试患者样本，以检测血液中特定的卵巢癌标志物。此过程提供了独特的平台技术，在简单性、低成本、有希望的检测限制以及应用于广泛应用的能力方面，与现有技术具有改进。
通过这项工作，我们的目标是建立我们的卵巢癌靶向纳米粒子系统，以测试外体患者样本的CTC。这种高度通用的PAFC系统能够扩展用于临床用途，测试血液中是否存在广泛的生物标志物。正确的光学校准对于光音流细胞仪系统内目标的检测至关重要。
此外，为确保适当的声学耦合，请确保玻璃滑动和传感器之间没有气泡。由于流系统及其组件的自定义性质，该方法的可视化有利于准确再现。在通风化学烟气罩中，通过无菌的 0.2 微米过滤器过滤大约 300 毫升的去虚拟化水。
将 0.0134 克氯化铜和 100 毫升去离子水加入干净的 250 毫升圆形底瓶中，形成 1 毫摩尔氯化铜溶液。在烧瓶中加入0.015克叶酸，并使用磁搅拌棒混合溶液约5分钟。然后将0.024克硫化钠与100微升的去离子水混合。
使用 200 微升移液器在大约 10 秒的持续时间内缓慢地将此溶液添加到反应混合物中。盖住反应容器。将容器放在设置为 90 摄氏度的油浴中，然后继续搅拌。
大约 15 分钟后或当油浴达到 85 至 90 摄氏度的温度范围时，让反应继续一个小时。反应完成后，从油浴中取出反应容器，在室温下冷却 10 至 15 分钟，然后转移到冰浴中。冷却反应后，使用一个氢氧化钠将 pH 调整到大约 10。
将混合物加入15毫升批次的30千吨离心柱中，以3，082倍g离心15分钟，净化反应混合物。首先，在新鲜 RPMI 介质中以适当的浓度混合叶酸封顶铜硫化纳米颗粒。将此纳米颗粒溶液添加到准备好的 24 井板的每个井中，该井包含 SK-OV-3 细胞，浓度为每毫升 400 微克。
在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育两个小时。在此之后，用0.5毫升0.25%的三辛和EDTA对细胞进行三试。要中和三辛，添加至少一毫升无叶酸RPMI 1640完整生长介质，并将细胞以123倍g离心6分钟。
要清洗细胞，请取出上一代，将细胞重新用两毫升PBS重新暂停，以123倍g离心6分钟。重复此洗涤步骤两次，以去除任何未绑定的纳米颗粒。然后在PBS中用1到2毫升的2%Tween溶液重新给细胞。
使用血细胞计和锥蓝计算细胞。将PBS中2%Tween溶液中的细胞稀释到所选浓度进行检测。使用提供的三维 STL 文件，使用 ABS 热塑性塑料或 PLA 塑料对流量罐进行 3D 打印。
打印油箱后，清洁并组装系统以使用。将玻璃盖玻片放在一毫米三毫米槽和流系统一厘米孔上，用硅胶小心密封，防止泄漏。接下来，将毛细管放入硅胶固化管中。
通过流槽的一侧将管子插入流室，使玻璃毛细管直接位于三毫米槽和一厘米孔的正上方和前面。用硅胶密封管子。然后将传感器连接到超声波脉冲器和接收器。
用 59 分贝增益放大信号。将滤波器的输出连接到配备内置现场可编程栅门阵列的多用途可重新配置示波器。将来自流量室的一根管子连接到连接到每个分支两个注射器泵的 T 接头。
将其中一个注射器泵充满空气，用要分析的样品填充另一个泵。将包含空气的泵设置为每分钟 40 微升的流速，将包含样品的泵设置为每分钟 20 微升的流速。接下来，将流出流量系统的剩余管连接到 10% 漂白剂的容器，以在细胞退出流系统后处理细胞。
将石英毛细管部分与传感器直接对齐，置于显微镜的现场视野中，以便小心地将光纤放置在样品上方，以便照亮管的整个宽度。使用光纤照射样品，将波长为 1，053 纳米的二极管泵送固态激光器照射。使用显微镜安装的摄像机记录流、激光的发射以及样品通过流系统的通过。
本研究利用光音流细胞仪和靶向铜硫化物靶向剂检测卵巢循环肿瘤细胞。合成纳米粒子的典型 TEM 图像显示，典型纳米粒子的平均尺寸约为 8.6 纳米。然后，每个粒子的水平和垂直直径相互垂直测量，并进一步平均。
这些粒子的平均流体动力学直径为73.6纳米。硫化铜纳米粒子具有一种典型的吸光曲线，可延伸至近红外。有一个轻微的伪影约850纳米，是由激光开关的分光光度计造成的。
用荧光标记的纳米粒子孵育的细胞的荧光显微镜图像显示，纳米粒子吸收可以通过整个细胞的荧光来可视化。未用纳米粒子孵育的细胞没有荧光信号。此荧光信号的存在表明粒子的成功吸收及其在流系统中被检测到的能力。
此处显示了典型数据采集信号的示例。原始数据表明纳米粒子标记细胞、PBS和叶酸封顶铜硫化纳米粒子之间的信号差异。利用自定义实验室视图和MATLAB软件，分别对正负控制进行实时和采集后的图像重建。
单个包络器随后转换为像素值并显示为独立列。PBS 和叶酸封顶硫酸铜纳米粒子之间光音信号的显著差异，浓度为每毫升 100 微克。在此过程期间，在光声流细胞仪系统中正确对齐超声波传感器、显微镜和光纤至关重要。
通过测试阳性和阴性控制来确认系统对齐。由于光音定位技术的多功能性以及使用PAFC的可能广泛的应用，该技术为翻译重要的临床和研究应用铺平了道路。为确保临床应用，进一步的研究应侧重于患者样本的检测和减少程序步骤。
纳米粒子的合成应在使用适当的防护设备进行化学烟罩中。人体细胞系必须按照您机构的准则处理。使用激光需要辐射安全培训和适当的 PPE。
激光使用和光音测试只能由训练有素的人员执行。
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