Neuroscience
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Système de micro-injectrode pour l'infusion combinée de drogue et l'électrophysiologie
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Nous présentons un système de micro-injectrode conçu pour l'électrophysiologie et la livraison assistée de sondes expérimentales (c.-à-d. nanocapteurs, microélectrodes), avec perfusion de drogue facultative. Les composants microfluidiques largement disponibles sont couplés à une canule contenant la sonde. Un protocole étape par étape pour la construction de microinjectrode est inclus, avec des résultats pendant l'infusion de muscimol dans le cortex macaque.
Transcript
Ce système de microinjectrode est conçu pour l’infusion de médicaments, l’électrophysiologie et la livraison et la récupération de sondes expérimentales telles que les microélecrodes et les nanocapteurs. Il est optimisé pour une utilisation répétée chez les animaux éveillés se comportant avec des dommages mineurs de pénétration aux tissus environnants. Le système de microinjectrode peut être configuré à plusieurs fins.
Le premier est un arrangement simple de la canule pour le placement d’une sonde expérimentale qui serait autrement trop fragile pour pénétrer le mater dura. Le second est une infusion microfluidique d’un médicament indépendamment ou couplée à une canule contenant une sonde expérimentale. Les composants microfluidiques du système permettent la livraison de volumes à l’échelle nanolimétrique.
Mesurer la longueur de la canule et la sonde nanocapteur ou microélecrode. La sonde doit être plus longue que la canule par la longueur qui doit dépasser de la pointe de canule plus approximativement un centimètre. Sous une loupe, chargez la sonde dans la canule par le dos pour protéger la pointe de la sonde.
Insérez la canule contenant la sonde dans la jonction T à partir de la ferrule inférieure. Placez le côté plat supérieur de la canule au milieu de la jonction T. Évitez de bloquer la jonction par la canule en la rétractant dans la jonction, puis serrez-la.
Fixer un tube sur le dessus de la microélecrode. Le dos charge le microélecrode à travers le tube capillaire, la jonction T, la canule et les ferrules correspondants. Couper la microélecrode à la longueur désirée et gratter l’extrémité.
Assurez-vous que l’extrémité arrière de l’électrode dépasse à moins d’un centimètre de l’arrière du tube capillaire et que la pointe de l’électrode dépasse de la canule à la distance désirée sur le côté inférieur. Placez le terminal microélecrode dans la goupille d’or et soudez la goupille d’or jusqu’au terminal microélecrode. Ajouter de la colle époxy entre la goupille dorée et la ferrule supérieure pour fixer la microélecrode à la ferrule.
Une fois l’époxy guéri, de préférence pendant plus de 24 heures, dévissez la ferrule supérieure pour vous assurer que la microélecrode se rétracte complètement à l’intérieur de la canule. Pour construire le circuit microfluidique, placez une large planche sur une surface stable. Placez les deux vannes à trois voies parallèles aux côtés les plus longs de la large planche à environ 12 centimètres l’une de l’autre, un port se faisant face.
Utilisez des vis pour fixer les vannes à la large planche et couper encore 10 centimètres de tuyaux capillaires pour la ligne de règle et le placer entre les deux. Utilisez des ferrules standard pour resserrer le tube jusqu’aux ports orientés des vannes. Coupez 10 à 20 centimètres du tube capillaire et utilisez les ferules standard et les connecteurs de verrouillage Luer pour connecter le tube de la seringue à l’un des ports de la vanne d’entrée.
Coupez un petit morceau de capillaire et connectez-le à la vanne de sortie comme ligne de chasse d’eau. Coupez deux plus longs morceaux de tubes capillaires d’environ 100 centimètres pour connecter la valve de sortie à la microinjectrode. Connectez la pompe à drogue et la pompe marqueur à la soupape d’entrée.
Tout d’abord, assurez-vous que la sonde expérimentale microélecrodée est rétractée dans la canule. Pour attacher un adaptateur sur mesure à la microinjectrode à l’aide de vis, chargez le microinjectrode à travers le tube de guidage et fixez-le à l’adaptateur de micro entraînement sur mesure à l’aide d’une paire de vis. Mesurez la profondeur de la position de micro entraînement à laquelle la microinjectrode dépasse du tube guide, puis rétractez-la d’un centimètre pour préparer l’insertion.
Pour les expériences de microinfusion, connectez la lignée cérébrale à l’ouverture inutilisée de la jonction T de la microinjectrode. Utilisez une ferrule standard et serrez-la avec la clé de ferrule. Assurez-vous que la ferrule supérieure est serrée ainsi.
Ensuite, placez le micro lecteur au-dessus d’un bécher. Chargez la chlorhexidine à 20 grammes par litre dans la seringue étanche au gaz d’un millilitre et placez-la dans la pompe à drogue. Tournez la direction d’écoulement des valves et réglez un faible débit de 50 à 200 microlitres par minute de sorte que le fluide passe de la pompe à drogue à travers la valve d’entrée à la valve de sortie et à la ligne du cerveau.
Rincer le circuit avec de la chlorhexidine pendant au moins 10 minutes. Répétez la chasse d’eau avec la solution saline stérile, puis avec de l’air. Appliquez délicatement des lingettes sans peluche aux jonctions pour aider à révéler les fuites liquides à travers les ferrules.
L’étape la plus critique consiste à vérifier que l’assemblage du circuit injectrode et microfluidique est exempt de fuites. Chargez le médicament dans la seringue étanche au gaz de 500 microlitres, compressez l’air et placez-le dans la pompe à drogue. Réglez le débit à 50 microlitres par minute et laissez le liquide voyager jusqu’à ce qu’il reste quelques gouttes dans la microinjectrode.
Ensuite, faire tremper le tube guide dans de la chlorhexidine à la concentration de 20 grammes par litre pendant 15 minutes. Tournez la direction de la vanne de sortie vers la ligne de rinçage pour déplacer le marqueur au fur et à mesure que la pompe marqueur est avancée jusqu’à ce qu’un bord clair de couleur et d’huile soit observé sur la ligne de commande. Assurez-vous qu’il ya toujours de l’huile entre le médicament et la couleur afin de ne pas mélanger les deux matériaux solubles dans l’eau et de perdre le bord tranchant entre eux.
Marquez la position de départ de cette ligne de teinture à l’huile. Après la configuration expérimentale nécessaire, rétractez la microélecrode dans la canule en desserrant la ferrule supérieure. Fixez le micro lecteur à la chambre d’enregistrement et abaissez le tube de guidage pour pénétrer dans le dura.
Ensuite, abaissez la microinjectrode à environ deux millimètres au-dessus du site d’enregistrement situé dans le cerveau. Serrez la ferrule supérieure et connectez les broches d’or au système d’enregistrement. Continuez à avancer la microinjectrode vers le site cible.
Ensuite, passez la valve de sortie à la ligne du cerveau. Pour les expériences d’infusion, utilisez la pompe manuelle à microsyringe pour déplacer la colonne d’huile de 0,5 centimètre par minute. Une fois que le volume désiré a été infusé, passez la soupape de sortie vers la ligne de rinçage.
Dans cette étude, l’injection d’un agoniste GABA A par le secteur fef de l’hémisphère droit a été exécutée pour l’inactivation réversible du champ frontal d’oeil tandis que l’animal a fini une tâche de saccade mémoire-guidée. L’intrigue polaire montre la performance de l’excentricité pour différents endroits par rapport au point de fixation. La performance a clairement diminué dans l’hémifield visuel gauche deux heures après injection.
Des traces de saccade pour huit emplacements périphériques de mémoire avant et après l’injection de Muscimol dans le FEF sont montrées ici. La précision de saccade dans l’hémifield visuel gauche a diminué après injection de Muscimol. Une fois la configuration terminée, la méthode est très fiable et robuste.
Cependant, en raison de la précipitation de petites molécules dans le tube et les ports, un rinçage complet est nécessaire avant chaque utilisation et après chaque expérience afin de garder le microfluidique exempt d’obstructions et de fuites. Bien que la méthode ait été démontrée dans le champ d’oeil frontal dans un primate non humain, le principe peut être appliqué à n’importe quelle autre région de cerveau où une certaine combinaison de stimulation électrique, d’enregistrement, et d’injection de drogue sont désirées dans les espèces de taille de rongeur ou plus grandes. Notre système a la flexibilité d’être utilisé pour l’enregistrement indépendamment ou en combinaison avec l’injection de drogue et a la capacité de placer précisément n’importe quelle sonde expérimentale fragile protégée contre les dommages par le dura mater et le tissu neural avec des dommages minimes de tissu dus à son petit diamètre de canule.
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Neurosciences Numéro 153 Electrophysiologie mononeurone perfusion de médicaments stimulation électrique comportement nanocapteur primate rongeur microfluidiqueRelated Videos
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