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Un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi
Chapters
Summary November 15th, 2019
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Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare e neurodegenerazione glaucomatosa negli occhi del topo mediante iniezione intracamerale di olio di silicone e la procedura per la rimozione dell'olio di silicone dalla camera anteriore per restituire una pressione intraoculare elevata a Normale.
Transcript
Il glaucoma è la principale causa di cecità irreversibile, caratterizzata dalla morte delle cellule gangliari retiniche e dall'opto-neurodegenerazione. L'elevazione della pressione intraoculare, chiamata anche ipertensione oculare, è il fattore di rischio più riconosciuto per il glaucoma. Un modello di ipertensione oculare semplice ma efficace negli animali da esperimento come i topi è importante per indagare i glaucometri nella neurodegenerazione e testare il trattamento per la neuroprotezione.
Pertanto, con i risultati, sviluppiamo un modello di ipertensione oculare del topo che imita da vicino il glaucoma secondario osservato nei pazienti umani. Questo modello replica fedelmente il glaucoma secondario causato dall'olio di silicone indotto per il blocco pupillare. La procedura è semplice l'elevazione IOP è stabile, e se la neurodegenerazione associata all'ipertensione oculare è grave negli occhi del topo, ancora più importante, l'ipertensione oculare è reversibile perché l'olio di silicone può essere facilmente rimosso dagli occhi del topo.
A dimostrare la procedura sarà il dottor Fang Fang, un tizio post-operatorio del mio laboratorio. Per iniziare, fare una micropipetta di vetro per l'iniezione intracamerale di olio di silicone tirando un capillare di vetro con un estrattore di pipetta. Tagliare un'apertura sulla punta della micropipetta e affilare la punta utilizzando una smussatura a micro-smerigliatrice per realizzare una smussatura da 35 a 40 gradi.
Lucidare i bordi della smussatura e lavarla con acqua per rimuovere tutti i detriti. Autoclavare la micropipetta prima dell'uso. Per preparare l'ago di paracentesi per l'ingresso corneale, attaccare un ago calibro 32 a una siringa da cinque millilitri su una serratura di esca e fissarlo ulteriormente con del nastro adesivo.
Piegare la punta smussata dell'ago, a faccia in su, a 30 gradi. Per preparare l'iniettore di olio di silicone, attaccare e fissare un ago contundente calibro 18 su una siringa da 10 millilitri. Quindi attaccare un tubo di plastica con l'ago calibro 18 su un'estremità e riempire con olio di silicone se necessario attraverso l'altra estremità.
Dopo aver anestetizzante un topo 6J nero C57 di nove-10 settimane, controlla la mancanza di risposta al dito del piedino con la mancanza di movimento dei baffi o della coda. Posizionare il mouse in posizione laterale su una piattaforma chirurgica. Applicare una goccia di cloridrato di proparacaina al 5% sulla cornea prima dell'iniezione per ridurne la sensibilità durante la procedura.
Utilizzare l'ago di paracentesi calibro 32 per fare un'incisione di ingresso al quadrante super temporale a circa 5 millimetri dal limbo. Tunnel attraverso gli strati della cornea per circa 3 millimetri prima di penetrare nella camera anteriore, facendo attenzione a non toccare l'obiettivo o l'iride. Ritirare lentamente l'ago per rilasciare circa uno o due microlitri di umorismo acquoso dalla camera anteriore attraverso il tunnel e attendere circa otto minuti per ridurre ulteriormente la pressione intraoculare.
Misurare l'occhio di controllo contralaterale per determinare la pressione. Inserire la micropipetta di vetro precaricata con olio di silicone attraverso il tunnel corneale nella camera anteriore con la smussatura rivolta verso il basso nella superficie del diaframma. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per iniettare olio di silicone nella camera anteriore fino a quando la goccia d'olio copre la maggior parte della superficie dell'iride, di circa 2,3-2,4 millimetri di diametro.
Lasciare la micropipetta nella camera anteriore per altri 10 secondi prima di ritirarla lentamente. Spingere delicatamente la palpebra superiore per chiudere l'incisione della cornea per ridurre al minimo la perdita di olio di silicone. E poi applicare un unguento antibiotico sulla superficie oculare.
Tenere il mouse sulla pastiglia di riscaldamento fino a quando non viene completamente recuperato dall'anestesia. Per rimuovere l'olio di silicone dalla camera anteriore, anestetizzare il mouse e quindi verificare la mancanza di risposta al dito del piedino per determinare la forza anestetica e la mancanza di movimento dei baffi o della coda. Posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica e fissarlo in posizione laterale con nastro adesivo.
Applicare una goccia di cloridrato di proparacaina al 5% sulla cornea per ridurne la sensibilità. Utilizzando l'ago di paracentesi prefatti calibro 32, fare due incisioni nel quadrante temporale della cornea tra le due e le cinque circa sul bordo della goccia di olio di silicone. Inserire un ago di irrigazione calibro 33 collegato a una soluzione irrigua attraverso un'incisione corneale alla massima velocità.
Inserire un altro ago di drenaggio calibro 33 attaccato alla siringa senza pistone attraverso l'altra incisione corneale per consentire alla goccia di olio di silicone di uscire dalla camera anteriore mentre si irriga con soluzione irrigata. Ritirare l'ago di drenaggio quindi l'ago di irrigazione. Utilizzare una micropipetta di vetro collegata a una siringa Hamilton per iniettare una bolla d'aria nella camera anteriore per mantenere la sua profondità normale e premere per chiudere l'incisione corneale.
Applicare unguento antibiotico su entrambi gli occhi e tenere il mouse sul tampone di recupero del riscaldamento fino a quando non è completamente recuperato dall'anestesia. Posizionare il mouse in una camera di induzione. Anestetizzarlo come descritto nel manoscritto e mantenere la sua cornea umida applicando lacrime artificiali durante tutta la procedura.
Attendere circa 15 minuti per consentire all'alunno di dilatarsi completamente. Misurare l'IOP di entrambi gli occhi utilizzando un tonometro in base alle istruzioni del prodotto. Portare il tonometro vicino all'occhio del mouse, mantenendo la distanza dalla punta della sonda alla cornea del topo a circa tre o quattro millimetri.
Premere il pulsante di misurazione sei volte per generare una lettura e ottenere tre letture generate dalla macchina da ogni occhio per acquisire l'IOP medio. Eseguire l'immunoistochimica delle cellule gangli retiniche retiniche a montaggio intero contando sezioni semisottili del nervo ottico e quantificando gli assoni sopravvissuti sugli animali sacrificati otto settimane dopo l'iniezione di olio di silicone. La pressione intraoculare degli occhi del topo con goccioline di olio di silicone superiori a 1,6 millimetri è stata misurata una volta alla settimana per otto settimane, dopo una singola iniezione di olio di silicone.
La pressione dell'occhio che riceve l'olio è rimasta alta, per lo più il doppio della pressione dell'occhio di controllo conlaterale che indica un efficace blocco della pupilla. In un altro gruppo di topi, l'olio di silicone è stato lavato dalla camera anteriore due settimane dopo l'iniezione. Dopo aver aspettato una settimana per consentire alla cornea di riprendersi, la pressione intraoculare è tornata alla normalità, la stessa dell'occhio di controllo.
Per determinare gli effetti dell'ipotensione oculare indotta dall'olio di silicone sulle cellule gangliari retiniche, i somi sopravvissuti nelle regioni periferiche dei supporti integrali retinali sono stati quantificati dalla colorazione RBPMS che mostra una drammatica morte cellulare ganglionare retinica dopo l'iniezione di olio di silicone. Gli assoni sopravvissuti nelle sezioni trasversali semisottile del nervo ottico sono stati quantificati dalla colorazione PBD otto settimane dopo l'iniezione. C'è stata una grande degenerazione dell'assone nell'ipertensione oculare indotta da olio di silicone.
Gli animali possono essere coniati con SLOOCT per determinare il cambiamento nella retina. Anche la funzione visiva degli animali può essere saggiata dal modello ERG e OKR. Questo modello di ipertensione oculare faciliterà lo studio della neurodegenerazione glaucometri indotta da IOP.
Può anche essere usato per testare preclinicamente terapie neuroprotettive promettenti.
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