Medicine
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マウスにおける可逆シリコンオイル誘発眼圧モデル
Chapters
Summary November 15th, 2019
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ここでは、シリコーンオイルのカメラインジェクションによるマウス目の眼圧高血圧および緑内化神経変性を誘導するプロトコルと、眼圧の上昇を戻すための前房からのシリコーンオイル除去の手順を提示する。通常。
Transcript
緑内障は、可逆性失明の主な原因であり、眼球神経節細胞死および検眼神経変性を特徴とする。眼圧の上昇は、眼圧と呼ばれ、緑内障の最も認識された危険因子である。マウスなどの実験動物における単純だが効果的な眼圧モデルは、神経変性の緑頂水計を調査し、神経保護のための治療をテストするために重要である。
結果を得て、ヒト患者に見られる二次緑内障を密接に模倣したマウスの眼圧モデルを開発する。このモデルは、瞳孔遮断のためにシリコーン油誘導によって引き起こされる二次緑内障を忠実に複製する。この手順は、IOP上昇が安定している単純であり、眼圧に関連する神経変性がマウス目に重篤である場合、さらに重要なことに、シリコーン油はマウスの目から容易に除去することができるので、眼圧性高血圧は可逆的である。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストオペフェローであるFang Fang博士です。まず、ピペットプーラーでガラスキャピラリーを引っ張って、イントラケルシリコーンオイル注入用のガラスマイクロピペットを作ります。マイクロピペットの先端の開口部をカットし、マイクログラインダーベベル機を使用して先端を研ぎ、35〜40度のベベルを作ります。
ベベルの端を磨き、水で洗ってすべての破片を取り除きます。使用前にマイクロピペットをオートクレーブ。角膜入り口用のパラセンテシス針を準備するには、32ゲージの針をルアーロックの5ミリリットルの注射器に取り付け、テープでさらに固定します。
針ベベル先端を面を上げて30度に曲げます。シリコーンオイルインジェクターを準備するには、10ミリリットルのシリンジに鈍い端18ゲージ針を取り付けて固定します。その後、一方の端に18ゲージ針を持つプラスチックチューブを取り付け、もう一方の端を通して必要に応じてシリコーンオイルでいっぱいになります。
9〜10週齢のC57黒6Jマウスを麻酔した後、ひげまたは尾の動きの欠如とつま先のピンチへの応答の欠如を確認してください。手術プラットフォーム上の横方向の位置にマウスを置きます。注射の前に5%プロパラカイン塩酸塩の1滴を角膜に塗布し、処置中の感度を低下させます。
32ゲージのパラセンテシス針を使用して、四肢から約5ミリメートルの超時間象限で切開を行います。角膜の層を約3ミリメートル貫通してから前房に突き刺し、レンズや虹彩に触れないように注意する。針をゆっくりと引き出して、前房からトンネルを通って約1〜2マイクロリットルの水性ユーモラスを放出し、約8分間待って眼内圧をさらに低下させます。
対側制御眼を測定して圧力を決定します。角膜トンネルを通してシリコーンオイルをプリロードしたガラスマイクロピペットを、斜め表面にベベルを下向きにして前房に挿入します。シリンジプランジャーをゆっくりと押し込み、オイル液滴が虹彩表面の大部分(直径約2.3~2.4ミリメートル)を覆うまで、シリコーンオイルを前房に注入します。
マイクロピペットを前房に10秒間放置してからゆっくりと引き出します。上まぶたを軽く押して角膜切開を閉じ、シリコーンオイルの漏れを最小限に抑えます。そして、目の表面に抗生物質軟膏を適用します。
麻酔から完全に回復するまで、加熱パッドの上にマウスを保管してください。前房からシリコーンオイルを取り除くために、マウスを麻酔し、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認して、麻酔強度とウィスカーまたは尾翼の動きの欠如を決定します。手術プラットフォーム上にマウスを置き、テープで横方向の位置に固定します。
5%プロパラカイン塩酸塩の1滴を角膜に塗布し、感度を下げます。あらかじめ作られた32ゲージのパラセンテシス針を使用して、シリコーンオイル液滴の端で約2〜5時の間に角膜の側頭象限に2つの切開を行います。最大速度で1角膜切開を通して灌漑液に接続された33ゲージの灌漑針を挿入する。
他の角膜切開部を通してプランジャーなしでシリンジに取り付けられた別の33ゲージの排水針を挿入して、シリコーンオイル液滴が灌漑液で灌漑しながら前房を出るようにします。排水針を引き出し、その後、灌漑針を引き出します。ハミルトンシリンジに接続されたガラスマイクロピペットを使用して、空気泡を前房に注入して通常の深さを維持し、角膜切開部を閉じます。
両眼に抗生物質軟膏を塗布し、麻酔から完全に回復するまで、加熱回復パッド上にマウスを維持します。マウスを誘導チャンバーに入れます。原稿に記載されているように麻酔をかけ、手順全体に人工涙を塗布することによって角膜を湿らせたままにします。
生徒が完全に拡張できるように約15分待ちます。製品の指示に従って眼圧計を使用して両眼のIOPを測定します。眼圧計をマウスの目の近くに持ってきて、プローブの先端からマウス角膜までの距離を約3〜4ミリメートルに保ちます。
測定ボタンを6回押して1つの読み取り値を生成し、各目から3つの機械生成測定値を得て平均IOPを取得します。全マウントレチナ・レチナル神経節細胞計数の免疫組織化学を行い、シリコーンオイル注射後8週間で犠牲となった動物に生き残った軸索の定量を行う。1.6ミリメートルを超えるシリコーン油滴を有するマウス眼内圧を、1回のシリコーン油注入後、週1回8週間測定した。
油を受け取る眼の圧力は高いままで、主に効果的な瞳孔遮断を示す対側対照眼の圧力の2倍であった。マウスの別のグループでは、シリコーンオイルは、注射の2週間後に前房から洗い流された。角膜が回復するのを1週間待った後、眼圧はコントロールアイと同じ正常に戻った。
シリコーン油誘発眼低血圧が神経節細胞のレチナル細胞に及ぼす影響を調べるため、リコーンオイル注入後の劇的な腎細胞死を示すRBPMS染色により、残存する全型マウントの末梢領域の生き残ったソマタを定量した。視神経半薄い断面の生き残った軸索は、注射の8週間後にPBD染色によって定量化された。シリコーン油誘発性高眼圧症には大きな軸索変性があった。
動物は、Retinaの変化を決定するためにSLOOCTで画像化することができます。動物の視覚機能は、同様に、パターンERGおよびOKRによってアッセイすることができる。この眼圧モデルは、高IOP誘導緑度計神経変性症の調査を容易にする。
また、前臨床的に有望な神経保護療法をテストするために使用することができます。.
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