Cancer Research
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ऐरेगए पुस्तकालयों की मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और ड्यूल-लूसिफ़ेरेज़-आधारित रिपोर्टर का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर नियामकों की पहचान
Chapters
Summary March 27th, 2020
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प्रतिलेखन कारकों के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए, हमने दोहरी-लुसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शन रिपोर्टर परख का उपयोग करके सरणी लेंटिवायरल या रेट्रोवायरल आरएनएआई पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया। यह दृष्टिकोण एक ही प्रयोग में सैकड़ों उम्मीदवारों को स्क्रीन करने का एक त्वरित और अपेक्षाकृत सस्ता तरीका प्रदान करता है।
Transcript
इस प्रोटोकॉल का उपयोग कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए सरणी लेंटीवायरल या रेट्रोवायरल परख पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि यह तेजी से, मध्यम थ्रूपुट और सस्ती है, और यह उपकरणों और अभिकर् ती का उपयोग करता है जो आमतौर पर अधिकांश जांचकर्ताओं के लिए सुलभ होता है। पुस्तकालय में प्रत्येक लेंटीवायरल वेक्टर का विस्तार और शुद्ध करने के लिए, पहले 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एम्पीसिलिन के 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक लुरिया शोरबा के 1.3 मिलीलीटर जोड़ें।
37 डिग्री सेल्सियस और प्रति मिनट 225 क्रांतियों पर एक रात इनक्यूबेशन के लिए ग्लिसरोल स्टॉक के दो माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से टीका लगाएं। अगले दिन, प्रत्येक बैक्टीरिया संस्कृति को अपकेंद्रित्र के लिए व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त बैक्टीरियल मिनीप्रेप किट के साथ प्रत्येक वेक्टर को शुद्ध करें।
तैयार पुस्तकालय में प्रत्येक वेक्टर के लिए, एक 24 अच्छी तरह से एक बार 10 से पांचवें 293FT कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से बीज और ३७ डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट । एक ट्रांसफैक्शन मिश्रण तैयार करने के लिए जो पुस्तकालय में प्रत्येक वेक्टर के लिए स्थापित किया जाएगा, पहले प्रत्येक लेंटीवायरल वेक्टर को नाभिक मुक्त पानी के साथ 50 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए एल्यूट करें। प्रत्येक कमजोर पड़ने के पांच माइक्रोलीटर को 96-वेल पीसीआर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें।
23.75 माइक्रोलीटर टाइम्स एक्स ऑफ प्री-वार्म्ड ट्रांसफेक्शन बफर के साथ ट्रांसफेक्शन रीएजेंट के 1.25 माइक्रोलीटर टाइम्स एक्स को मिलाकर ट्रांसफैक्शन सुपर मिक्स करें। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्रांसफैक्शन सुपर मिक्स को इनक्यूबेट करें। इसके बाद वीएसवीजी के 125 नैनोग्राम टाइम्स एक्स और वीएसवीजी के 125 नैनोग्राम टाइम्स एक्स को कोमल पिपटिंग के साथ सुपर मिक्स में जोड़ें।
तुरंत एक पीसीआर पट्टी की प्रत्येक ट्यूब में सुपर मिश्रण aliquot और पतला वायरल वेक्टर के प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 25 माइक्रोलीटर हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, पहले से तैयार 24-अच्छी प्लेट में 293FT कोशिकाओं के एक इसी कुएं में प्रत्येक ट्रांसफैक्शन मिश्रण के 30 माइक्रोलीटर को स्थानांतरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर में एक और 24 घंटे की इनक्यूबेशन के लिए ताजा पूर्ण विकास माध्यम के ५०० माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम की जगह से पहले 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट ।
अगले दिन, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग प्रत्येक कुएं से वायरल सुपरनेट इकट्ठा करने के लिए करें और प्रत्येक सुपरनेट के 220 माइक्रोलीटर को एक नई 96-अच्छी प्लेट में दो कुओं में एक सरणी वायरल सुपरनेट प्लेट उत्पन्न करने के लिए। संक्रमण के लिए A375 कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, पुस्तकालय में प्रत्येक वायरल वेक्टर के लिए प्रति अच्छी तरह से पूर्ण विकास माध्यम के ०.५ मिलीलीटर में एक 24 अच्छी तरह से थाली में पांचवीं कोशिकाओं के लिए एक बार 10 बीज । एक अतिरिक्त अच्छी तरह से शामिल करें जो दवा चयन के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए संक्रमित नहीं होगा।
सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 24 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, तैयार सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं से विकास माध्यम को बदलने से पहले कमरे के तापमान पर जमे हुए लेरेवियरल सुपरनेटेंट सेट को गल लें, जिसमें 200 माइक्रोग्राम के माइक्रोलीटर विकास माध्यम पॉलीब्रेन के 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक है। एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक 96 से वायरल सुपरनेटेंट के 200 माइक्रोलीटर को 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 24 से 48 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं में माध्यम को प्यूरोमाइसिन के साथ पूरक विकास माध्यम के 500 माइक्रोलीटर के साथ बदलें और कोशिकाओं को अतिरिक्त 48 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। ४८ घंटे के प्यूरोमाइसिन चयन के बाद, कोशिकाओं को तीन या चार समूहों में सॉर्ट करें जैसे कि एक ही समूह में सभी कुओं में समान कोशिका घनत्व होता है और प्रत्येक समूह से ३७ डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट की इनक्यूबेशन के लिए एक प्रतिनिधि को ट्राइपसिन-EDTA के २०० माइक्रोलीटर जोड़ते हैं । एक बार कोशिकाओं को अलग कर दिया है, विकास माध्यम के ४०० माइक्रोलीटर के साथ ट्राइप्सिन बेअसर puromycin के साथ पूरक और प्रत्येक ट्रिप्सिनाइज्ड अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या गिनती ।
प्रत्येक कोशिका निलंबन को दो बार 10 से पांचवीं कोशिकाओं को विकास माध्यम के साथ पांचवें कोशिकाओं के लिए पतला करें, जो प्रत्येक कुएं से कोशिकाओं के 500 माइक्रोलीटर को एक नई 24-अच्छी प्लेट में एक ही अच्छी स्थिति में पूरक करता है। प्रत्येक प्रतिनिधि से गिनती का उपयोग करने के बाद अच्छी तरह से प्रत्येक समूह में अच्छी तरह से शेष में सेल संख्या का अनुमान लगाने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रिप्पसिन-EDTA की उचित मात्रा जोड़ने के लिए मिलीलीटर एकाग्रता प्रति छठी कोशिकाओं के लिए एक बार 10 प्राप्त करने के लिए । ट्राइपसिनाइजेशन के दौरान, नई 24-अच्छी प्लेट में उचित संबंधित कुओं में प्यूरोमाइसिन के साथ पूरक विकास माध्यम के 400 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
एक बार कोशिकाओं को अलग कर दिया है, धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से सामग्री मिश्रण और नए 24 अच्छी तरह से थाली में उचित इसी अच्छी तरह से प्रत्येक सेल निलंबन के १०० माइक्रोलीटर हस्तांतरण । फिर कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। ड्यूल-लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर संरचनाओं के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, तालिका में इंगित ट्रांसफैक्शन कमजोर पड़ने का मिश्रण तैयार करें।
रिपोर्टर कमजोर पड़ने मिश्रण तैयार करने के लिए, ट्रांसफैक्शन की कुल संख्या के साथ-साथ कई अतिरिक्त मात्रा से गुणा प्रत्येक अभिकर्षक की मात्रा को मिलाएं। इसके बाद, ट्रांसफेक्शन कमजोर पड़ने वाले मिश्रण को रिपोर्टर कमजोर पड़ने के मिश्रण के साथ मिलाएं और ट्रांसफेक्शन मिश्रण का उत्पादन करने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर परिणामी समाधान को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर के साथ सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं को कुल्ला करें और प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा पूर्ण विकास माध्यम के 447 माइक्रोलीटर जोड़ें।
फिर सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण के 53 माइक्रोलीटर वितरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। थाली को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड को 24 घंटे के लिए रखें। लूसिफ़ेरेस गतिविधि को मापने के लिए, डिएकाइज्ड पानी के साथ एक-से-पांच कमजोर पड़ने पर लूसिफ़ेरेस गतिविधि किट से 5X निष्क्रिय लाइसिस बफर को पतला करें और किट से रिएजेंट ए और रिएजेंट बी बफर की आवश्यक मात्रा को पिघला दें।
जब रिएजेंट तैयार हो जाते हैं, तो प्रत्येक कुएं में सुपरनिटेंट को निष्क्रिय लाइसिस बफर के 75 माइक्रोलीटर के साथ बदलें और कभी-कभी मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, किट से 50X अभिकर्मक बी सब्सट्रेट को गल-टू-50 एकाग्रता के साथ गल ना गल कर बी बफर के साथ पतला करें। इनक्यूबेशन के अंत में, निष्क्रिय लाइसिस बफर के 30 माइक्रोलीटर को चार खाली नियंत्रण कुओं में जोड़ें और प्रत्येक कुएं से 96-अच्छी तरह से फ्लैट बॉटम सफेद परख प्लेट के डुप्लिकेट कुओं में 30 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें।
जब सभी लिसेट चढ़ाया गया है, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से अभिवात एक के ५० माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए और एक थाली पाठक के साथ जुगनू लूसिफ़ेरेस संकेत पढ़ें । फिर प्रत्येक कुएं में रिएजेंट बी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें और एक प्लेट रीडर के साथ रेनिला लूसिफ़ेरेस सिग्नल पढ़ें। जैसा कि अपेक्षित था, YAP2SA जुगनू लूसिफ़ेरेस गतिविधि बढ़ाता है लेकिन नियंत्रण वेक्टर की तुलना में रेनिला लूसिफ़ेरेस गतिविधि नहीं है।
इसके विपरीत, YAP2SA S94A जुगनू लूसिफ़ेरेस गतिविधि में वृद्धि नहीं करता है। महत्वपूर्ण बात, YAP2SA एक न्यूनतम प्रमोटर निर्माण की गतिविधि को नहीं बदलता है जिसमें एमसीएटी टीड बाध्यकारी तत्वों का अभाव है। YAP-TAZ-TEAD रिपोर्टर निर्माण के साथ संक्रमित कोशिकाओं में, मिलकर YAP और TAZ छोटे हेयरपिन काफी जुगनू लूसिफ़ेरेस के स्तर को कम है, लेकिन नियंत्रण छोटे हेयरपिन गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण नहीं है ।
इसके विपरीत, न्यूनतम रिपोर्टर निर्माण से संक्रमित कोशिकाओं में, वाईएपी-ताज़ शॉर्ट हेयरपिन आरएनए जुगनू लूसिफ़ेरेस के स्तर को काफी बदल नहीं देता है। प्रत्येक कुएं में रेनिला सिग्नल को शॉर्ट हेयरपिन नॉन-टारगेटिंग कंट्रोल या वाईएपी-ताज़ शॉर्ट हेयरपिन आरएनए द्वारा भी काफी बदला नहीं जाता है। जैसा कि उम्मीद थी, याप और ताज़, SARC या PI3 kinase को लक्षित करने वाले छोटे हेयरपिन आरएनए ने YAP-TAZ-TEAD गतिविधि को काफी कम कर दिया है।
एटीएम, CDH1, CSK, ERBB2, और जेलसोलिन को लक्षित करने वाले लघु हेयरपिन आरएनए ने प्रकाशित अध्ययनों के अनुरूप सामान्यीकृत जुगनू लूसिफ़ेरेस स्तरों में वृद्धि की, जिसमें यह दर्शाया गया है कि ये प्रोटीन YAP और/या TAZ थे । अन्य सेल प्रकारों में एटीआर, सीसीएनई2 और ईआरबी 4 के लिए स्थापित भूमिकाओं के बावजूद, इन जीनों को लक्षित करने वाले छोटे हेयरपिन आरएनए A375 कोशिकाओं में सामान्यीकृत जुगनू लूसिफ़ेरेस स्तर को काफी नहीं बदलते हैं। इस स्क्रीन के बाद, नियामकों की पहचान उनके प्रतिलेखन कारक गतिविधि के लिए अन्य readouts का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए ।
परख द्वारा चिन्हित नियामक के प्रभावी नॉकआउट की भी पुष्टि की जानी चाहिए । सावधानी का उपयोग करने के लिए और संक्रामक लेंटीवायरस के साथ काम करते समय सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करने के लिए याद रखें, खासकर यदि वायरस मानव संक्रामक हैं।
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