Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Ce protocole peut être utilisé pour filtrer les bibliothèques d’analyse lentiviral ou rétroviral rangées afin d’identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, à débit moyen et peu coûteuse, et qu’elle utilise de l’équipement et des reagents couramment accessibles à la plupart des chercheurs. Pour agrandir et purifier chaque vecteur lentiviral de la bibliothèque, ajoutez d’abord 1,3 millilitres de bouillon Luria complétés par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline à chaque puits d’une plaque de puits profonde de 96 puits.

Inoculer chaque puits avec deux microlitres de stock de glycérol pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 225 révolutions par minute. Le lendemain, transférez chaque culture bactérienne dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour centrifugation. Purifiez chaque vecteur avec un kit de miniprep bactérien approprié selon les instructions du fabricant.

Pour chaque vecteur de la bibliothèque préparée, ensemencer un puits d’une plaque de 24 puits avec une fois 10 à la cinquième cellule 293FT et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour préparer un mélange de transfection qui sera mis en place pour chaque vecteur de la bibliothèque, étiez d’abord chaque vecteur lentiviral à une concentration finale de 50 nanogrammes par microlitre avec de l’eau sans nucléase. Transférer cinq microlitres de chaque dilution dans des puits individuels d’une plaque PCR de 96 puits.

Faire un super mix transfection en mélangeant 1,25 microlitres fois x de réacoupage de transfection avec 23,75 microlitres fois x de tampon transfection préchauffé. Incuber le super mélange transfection à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 125 nanogrammes x de psPAX2 et 125 nanogrammes x de VSVG au super mix avec pipetting doux.

Immédiatement aliquot le super mélange dans chaque tube d’une bande PCR et utiliser une pipette multicanal pour transférer 25 microlitres du mélange dans chaque puits de vecteur viral dilué. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, utilisez une pipette multicanal pour transférer 30 microlitres de chaque mélange de transfection de chaque puits dans un puits correspondant de 293 FT dans la plaque de 24 puits précédemment préparée. Incuber les cellules pendant 24 heures avant de remplacer le milieu de chaque puits par 500 microlitres de milieu de croissance complet frais pour une autre incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire.

Le lendemain, utilisez une pipette multicanal pour recueillir le supernatant viral de chaque puits et aliquot 220 microlitres de chaque supernatant dans deux puits dans une nouvelle plaque de 96 puits pour générer une plaque virale surnatante rangée. Pour préparer les cellules A375 à l’infection, semer une fois 10 à la cinquième cellule dans une plaque de 24 puits dans 0,5 millilitres de milieu de croissance complet par puits pour chaque vecteur viral de la bibliothèque. Inclure un puits supplémentaire qui ne sera pas infecté pour servir de contrôle pour la sélection des médicaments.

Après une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, décongeler le supernatant lentiviral uni congelé réglé à température ambiante avant de remplacer le milieu de croissance de chaque puits de la plaque de culture cellulaire préparée par 200 microlitres de milieu de croissance complétés par 20 microgrammes par millilitre de polybrene. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 200 microlitres de supernatant viral de chaque puits de 96 à chaque puits de la plaque de 24 puits. Retourner les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 à 48 heures.

À la fin de l’incubation, remplacer le milieu de chaque puits par 500 microlitres de milieu de croissance complétés par de la puromycine et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures supplémentaires. Après la sélection de puromycine de 48 heures, trier les cellules en trois ou quatre groupes de sorte que tous les puits d’un seul groupe ont une densité cellulaire similaire et ajouter 200 microlitres de trypsine-EDTA à un puits représentatif de chaque groupe pour une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec 400 microlitres de milieu de croissance complétés par de la puromycine et comptez le nombre de cellules de chaque puits trypsinisé.

Diluer chaque suspension cellulaire à deux fois 10 à la cinquième cellule par concentration millilitre avec un milieu de croissance complété par de la puromycine et des graines 500 microlitres de cellules de chaque puits dans la même position de puits dans une nouvelle plaque de 24 puits. Après avoir utilisé les dénombrements de chaque puits représentatif pour estimer le nombre de cellules dans chaque puits restant dans chaque groupe, ajouter le volume approprié de trypsine-EDTA à chaque puits pour atteindre une fois 10 à la sixième cellule par concentration millilitre. Pendant la trypsinisation, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 400 microlitres de milieu de croissance complétés par de la puromycine aux puits correspondants appropriés dans la nouvelle plaque de 24 puits.

Une fois que les cellules se sont détachées, mélanger délicatement le contenu de chaque puits et transférer 100 microlitres de chaque suspension cellulaire au puits correspondant approprié dans la nouvelle plaque de 24 puits. Retournez ensuite les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Pour transfecter les cellules avec les constructions du journaliste à double luciferase, préparez le mélange de dilution de la transfection tel qu’indiqué dans le tableau.

Pour préparer le mélange de dilution reporter, mélanger les volumes de chaque reagent multiplié par le nombre total de transfections plus plusieurs volumes supplémentaires. Ensuite, mélanger le mélange de dilution transfection avec le mélange de dilution reporter et incuber la solution résultante à température ambiante pendant 15 minutes pour produire le mélange de transfection. Pendant l’incubation, rincer chaque puits de la plaque de culture cellulaire avec 250 microlitres de PBS et ajouter 447 microlitres de milieu de croissance complet frais à chaque puits.

Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour distribuer 53 microlitres de mélange de transfection à chaque puits de la plaque de culture cellulaire. Placez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour mesurer l’activité de la luciferase, diluer le tampon de lyse passive 5X de la trousse d’activité de luciferase à une dilution d’un à cinq avec de l’eau déionisée et décongeler les volumes nécessaires de tampon réageni A et de tampon réapprovisionnement B du kit.

Lorsque les reagents sont prêts, remplacer le supernatant dans chaque puits par 75 microlitres de tampon de lyse passive et incuber la plaque pendant 30 minutes à température ambiante par des secousses occasionnelles. Pendant l’incubation, diluer le substrat B du réaccente 50X du kit à une concentration d’un à 50 avec tampon B décongelé. À la fin de l’incubation, ajouter 30 microlitres de tampon de lyse passive à quatre puits de contrôle vierges et transférer 30 microlitres de lysate de chaque puits dans des puits en double d’une plaque blanche à fond plat de 96 puits.

Lorsque tout le lysate a été plaqué, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de réaccente A à chaque puits et lire le signal luciferase firefly avec un lecteur de plaque. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de réaccente B à chaque puits et lire le signal Renilla luciferase avec un lecteur de plaque. Comme prévu, YAP2SA augmente l’activité de luciferase de luciferase mais pas l’activité de Luciferase de Renilla par rapport au vecteur de lutte.

En revanche, YAP2SA S94A n’augmente pas l’activité luciferase firefly. Fait important, YAP2SA ne modifie pas l’activité d’une construction de promoteur minimal qui n’a pas les éléments de liaison MCAT TEAD. Dans les cellules transfectées avec la construction de journaliste YAP-TAZ-TEAD, le tandem YAP et TAZ cheveux courts considérablement réduit les niveaux de luciferase luciferase firefly, mais le contrôle de contrôle de non-ciblage en épingle à cheveux courte ne le fait pas.

En revanche, dans les cellules transfectées avec la construction minimale de journaliste, l’ARN court d’épingle à cheveux de YAP-TAZ ne modifie pas significativement des niveaux de luciferase de luciferase de firefly. Le signal Renilla dans chaque puits n’est pas non plus modifié de manière significative par le contrôle de non-ciblage en épingle à cheveux courte ou l’ARN en épingle à cheveux courte YAP-TAZ. Comme prévu, les ARN à épingle à cheveux courtes ciblant yap et TAZ, SARC ou PI3 kinase réduit considérablement l’activité YAP-TAZ-TEAD.

Les ARN à épingle à cheveux courtes ciblant les ATM, CDH1, CSK, ERBB2 et gelsolin ont chacun augmenté les niveaux normalisés de luciferase de l’effiole de feu conformément aux études publiées montrant que ces protéines étaient YAP et/ou TAZ. En dépit des rôles établis pour ATR, CCNE2, et ERBB4 dans d’autres types de cellules, les ARN courts d’épingle à cheveux ciblant ces gènes ne changent pas significativement les niveaux normalisés de luciferase de lucifère de luciferase dans les cellules d’A375. À la suite de cet écran, l’identification des régulateurs doit être validée à l’aide d’autres lectures pour leur activité de facteur de transcription.

Le renversement effectif de l’organisme de réglementation identifié par l’essai devrait également être confirmé. N’oubliez pas de faire preuve de prudence et de suivre les directives de sécurité lorsque vous travaillez avec des lentivirus infectieux, en particulier si les virus sont infectieux pour l’homme.