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June 05, 2020
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हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग ऑर्गेनॉइड की संरचनात्मक जटिलता की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, जिससे एकल-कोशिका संकल्प पर इन 3 डी संरचनाओं में पहचान, सल्फेट और वितरण की मैपिंग की अनुमति मिलती है। हमारा त्वरित तीन दिवसीय प्रोटोकॉल विभिन्न मूल के ऑर्गेनॉइड के लिए पूरी तरह से अनुकूलित है और एक सीधा नमूना तैयारी का उपयोग करता है, जिसमें एक गैर-विषाक्त ऑप्टिकल समाशोधन कदम और सिलिकॉन-आधारित बढ़ते विधि शामिल हैं। यद्यपि हमारा प्रोटोकॉल सीधा है, उनमें से कुछ संगठित हैंडलिंग, या स्लाइड तैयारी जैसे महत्वपूर्ण कदम हैं, पाठ के माध्यम से दृश्य प्रदर्शन के माध्यम से बेहतर समझाया जा सकता है।
24 अच्छी तरह से प्लेटों में तहखाने झिल्ली निकालने में उगाए गए 100 से 500 माइक्रोमीटर व्यास ऑर्गेनॉइड को ठीक करने के लिए, प्रत्येक वेल्ड को 3 डी मैट्रिस को बाधित किए बिना पीबीएस के साथ काटा जा सकता है, और प्लेट को बर्फ पर रखें। प्रत्येक कुएं में बर्फ-ठंड वसूली समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें और प्लेट को 30 से 60 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक क्षैतिज शेखर पर रखें। पीबीएस समाधान में 1% बीएसए में एक मिलीलीटर पिपेट टिप्स को डुबोएं और बीएसए के साथ प्रत्येक टिप को कोट करने के लिए दो बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
इसके बाद, प्रति स्थिति 1 15 मिलीलीटर ट्यूब में 1% पीबीएस बीएसए के पांच मिलीलीटर जोड़ें, और ट्यूब के अंदर कोट करने के लिए समाधान को त्यागने से पहले दो से तीन बार ट्यूब को उलट दें। ऑर्गेनॉइड इकट्ठा करने के लिए, एक लेपित टिप का उपयोग करें ताकि अच्छी सामग्री को पांच से 10 बार धीरे-धीरे फिर से निलंबित किया जा सके, और प्रत्येक स्थिति से सभी ऑर्गेनॉइड को एक ही लेपित 15 मिलीलीटर ट्यूब में खींच लें। प्रत्येक को बर्फ-ठंडे 1% पीबीएस बीएसए के एक मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करना सुनिश्चित करने के लिए कि सभी ऑर्गेनॉइड एकत्र किए गए हैं, और वॉश को उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
प्रत्येक ट्यूब में अंतिम मात्रा को ठंडे पीबीएस के साथ 10 मिलीलीटर तक लाएं, और 3डी मैट्रिक्स की दृश्य परत के बिना एक तंग पैलेट प्राप्त करने के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा ऑर्गेनॉइड को तलछट करें। ऑर्गेनॉइड को ठीक करने के लिए, बर्फ ठंडे पैरा फॉर्मेल्डिहाइड के एक मिलीलीटर में प्रत्येक गोली को सावधानीपूर्वक निलंबित करने के लिए एक लेपित एक मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें, और 45 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। धीरे-धीरे ऑर्गेनॉइड को निर्धारण समय के माध्यम से आधे रास्ते में फिर से निलंबित करें।
४५ मिनट के बाद, 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रखने से पहले, प्रत्येक ट्यूब के लिए बर्फ ठंडा PBS प्लस ट्वीन 20 के 10 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से उलटा द्वारा मिश्रण । ऑर्गेनॉइड को ब्लॉक करने के लिए, इनक्यूबेशन के अंत में, नमूनों को स्पिन करें और बर्फ-ठंडे ऑर्गेनॉइड वाशिंग बफर प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया जाने वाले कम से कम 200 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें। फिर ऑर्गेनॉइड को 15 मिनट के लिए 24 कुओं के निलंबन प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें, इनक्यूबेशन चार डिग्री सेल्सियस पर।
इम्यूनोलबेलिंग के लिए एक खाली संदर्भ में ऑर्गेनॉइड धोने बफर के 200 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें, और ऑर्गेनॉइड को प्लेट के नीचे बसने की अनुमति दें। जब ऑर्गेनॉइड बस गए हैं, तो प्लेट को 45 डिग्री कोण पर झुकाएं ताकि सभी को हटाने की अनुमति दी जा सके लेकिन वॉश बफर के अंतिम 200 माइक्रोलीटर। इसके बाद, ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त ऑर्गेनॉइड वाशिंग बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्लेट को रात भर हल्के कमाल के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर रखें और प्रति मिनट 40 क्रांतियों पर मिलाते हुए।
अगली सुबह, प्रत्येक अच्छी तरह से ऑर्गेनॉइड वाशिंग बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें, और ऑर्गेनॉइड को तीन मिनट के लिए प्लेट के नीचे बसने की अनुमति दें। जब ऑर्गेनॉइड बस गए हैं, तो प्रत्येक कुएं से पिछले 200 माइक्रोलीटर को हटा दें, और ऑर्गेनॉइड को ताजा ऑर्गेनॉइड वॉशिंग बफर के एक मिलीलीटर के साथ धोते हुए, और हल्के कमाल और प्रति धोने मिलाते हुए धोएं। तीसरे धोने के बाद, ऑर्गेनॉइड को सभी को हटाने से पहले तीन मिनट के लिए थाली के नीचे बसने की अनुमति दें, लेकिन प्रत्येक अच्छी तरह से ऑर्गेनॉइड वाशिंग बफर के अंतिम 200 माइक्रोलीटर।
हल्के कमाल और मिलाते हुए चार डिग्री सेल्सियस पर एक रात के इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त ऑर्गेनॉइड वाशिंग बफर के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें । अगली सुबह, अंगों को प्रति वॉश ताजा ऑर्गेनॉइड वाशिंग बफर के एक मिलीलीटर में तीन दो घंटे की धोके के साथ धोएं, जैसा कि प्रदर्शन किया गया है। अंतिम धोने के बाद, ऑर्गेनॉइड को एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें, और अपकेंद्रित्र द्वारा ऑर्गेनॉइड एकत्र करें।
ऑर्गेनॉइड के ऑप्टिकल समाशोधन के लिए, ऑर्गेनॉइड को बाधित किए बिना, प्रत्येक ट्यूब से जितना संभव हो उतना वॉश बफर निकालें, और प्रत्येक गोली में कम से कम 50 माइक्रोलीटर फ्यूनजीआई जोड़ने के लिए संशोधित 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट इनक्यूबेशन के बाद ऑर्गेनॉइड को चार डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह तक या शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर छह महीने तक संग्रहित किया जा सकता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा ऑर्गेनॉइड इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार करने के लिए, एक सिलिकॉन सीलेंट के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और सिरिंज में एक संशोधित 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप संलग्न करें।
एक स्लाइड के बीच में एक बाय दो सेंटीमीटर का आयत खींचने के लिए सिरिंज का उपयोग करें, और आयत के बीच में मंजूरी दे दी ऑर्गेनॉइड रखने के लिए एक दूसरे संशोधित 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें। ऑर्गेनॉइड पर कवर स्लिप रखने के लिए, कवर के बाईं ओर को पहले फिसल जाएं, धीरे-धीरे कवर स्लिप को बाएं से दाएं कम करें जब तक कि कोई फंसी हुई हवा न हो। फिर धीरे-धीरे कवर स्लिप के सभी किनारों पर दबाव लागू करें ताकि इसे सिलिकॉन सीलेंट से मजबूती से संलग्न किया जा सके।
ऑर्गेनॉइड की छवि के लिए, स्लाइड को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें, और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एक बहु विसर्जन 25 एक्स उद्देश्य का चयन करें। फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए कम लेजर पावर का चयन करते हुए, उचित अधिग्रहण सेटिंग्स में माइक्रोस्कोप सेट करें। निचले छोर की ऊपरी सीमा को परिभाषित करने के लिए जेड स्टैक मोड का उपयोग करें, और जेड चरण आकार को इष्टतम सेट करें।
जब बड़े ऑर्गेनॉइड संरचनाओं, या कई ऑर्गेनॉइड को एक साथ इमेजिंग करते हैं, तो 10% ओवरलैप के साथ टाइलिंग मोड का उपयोग करें और ब्याज के क्षेत्र को इंगित करें। जब सभी पैरामीटर सेट किए गए हों, तो इमेजिंग सॉफ्टवेयर में इमेजिंग का 3डी प्रदान किया गया प्रतिनिधित्व प्राप्त करें, और चमक, विपरीत और 3 डी प्रतिपादन गुणों को अनुकूलित करें। फिर झगड़ा फ़ाइलों के रूप में परिणामों के आरजीबी स्नैपशॉट निर्यात करें।
2डी इमेजिंग की तुलना में 3डी इमेजिंग की ताकत माउस मैमरी ग्रंथि ऑर्गेनॉइड की इन छवियों द्वारा सचित्र है जो प्रदर्शन के रूप में उत्पन्न हुए थे। इन प्रतिनिधि ऑर्गेनॉइड की केंद्रीय परत में स्तंभकार आकार के K8/K18 सकारात्मक चमकदार कोशिकाएं होती हैं, और बाहरी परत में विस्तारित K5 सकारात्मक तुलसी कोशिकाएं होती हैं, जो वीवो में स्तन ग्रंथि की आकृति विज्ञान का पुनर्मूल्यांकन करती हैं। यह ध्रुवीकृत संगठन एक ही ऑर्गेनॉइड के 2डी ऑप्टिकल सेक्शन से सराहना करना चुनौतीपूर्ण है।
एक जटिल संरचना का एक और उदाहरण जो 3 डी जानकारी के बिना व्याख्या करना असंभव है एमआरपी 2 सकारात्मक कैनालिकुली का नेटवर्क है जो मानव यकृत ऑर्गेनॉइड के पित्त तरल पदार्थ के संग्रह को सुविधाजनक बनाता है। इसके अलावा, प्राप्त गुणवत्ता और संकल्प अर्ध-स्वचालित विभाजन और छवि विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, कुल सेल संख्या और मार्कर की उपस्थिति पूरे ऑर्गेनॉइड में विशिष्ट सेलुलर उपप्रकारों में निर्धारित की जा सकती है।
140 कोशिकाओं वाले पूरे ऑर्गेनॉइड के नाभिक को खंडित करके, Ki67 सेल चक्र मार्कर के लिए उच्च सकारात्मकता प्रदर्शित करने वाली तीन कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है। ऑप्टिकल समाशोधन एजेंट, FUnGI, एक ऑर्गेनॉइड के भीतर फ्लोरोसेंट सिग्नल गुणवत्ता में अस्पष्ट और फ्रक्टोज-ग्लिसरोल समाशोधन को मात देता है। FUnGI के साथ रेगेंडॉइड को मंजूरी दे दी है जो अस्पष्ट ऑर्गेनॉइड की तुलना में समग्र रूप से बढ़ी हुई फ्लोरेसेंस तीव्रता का प्रदर्शन करते हैं।
ध्यान दें कि नमूने में किसी भी बचे हुए बीएमई के परिणामस्वरूप एंटीबॉडी प्रवेश कम हो सकता है और उच्च पृष्ठभूमि संकेत हो सकता है। इसके अलावा, सिस्टिक ऑर्गेनॉइड को ऑप्टिकल रूप से साफ नहीं किया जाना चाहिए यदि वे गिर जाते हैं। प्रोटोकॉल के मामूली अनुकूलन के साथ, नमूनों का उपयोग सुपर रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल, मल्टी फोटॉन और लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के साथ किया जा सकता है।
ऑर्गेनॉइड की पूरी 3डी संरचना और सेलुलर सामग्री, साथ ही मूल ऊतक के साथ-साथ उनकी फेनोटाइपिक समानता को यहां वर्णित एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके कैप्चर किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को मूल, आकार और आकार में अलग-अलग ऑर्गेनॉइड की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।
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van Ineveld, R. L., Ariese, H. C., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids. J. Vis. Exp. (160), e60709, doi:10.3791/60709 (2020).
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