Genetics
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3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen
Chapters
Summary January 25th, 2020
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3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.
Transcript
3D-Mehrfarben-DNA-FISH ermöglicht die Visualisierung mehrerer genomischer Loci innerhalb konservierter Kerne, um ihre wechselseitige Interaktion und Lokalisierung auf Einzelzellebene mehrdeutig zu definieren. 3D-Multicolor-DNA FISH ermöglicht die direkte Untersuchung der Kernarchitektur. Im Allgemeinen arbeitet es in Verbindung mit Chromosomenerfassungs-basierten Technologien, die die Technik zu einem verfügbaren Werkzeug für die C-Datenvalidierung innerhalb einzelner Zellen machen.
Demonstration des Verfahrens wird Federica Marasca sein. Sie ist Postdoc in meinem Labor. Beginnen Sie mit der Inkubation des Nick-Übersetzungsmixes in einem Thermomischer bei 16 Grad Celsius entsprechend der Länge des Ausgangs-DNA-Materials.
Überprüfen Sie am Ende der Inkubation die Größe der Sonden auf einem 2,2%agarose Gel. Für jedes DNA-FISH-Experiment die entsprechende Sondenmenge gemäß dem Ausgangs-DNA-Material, aus dem die Sonden in 150 Mikroliter n. Chr. doppelt destilliertem Wasser, 20 Mikrogramm nicht gekennzeichneter Lachssperma-DNA, 3,5 Mikrogramm artspezifischer Cot-1-DNA, drei Bände n. 100% Ethanol und einem 1/10 Volumen von drei molarem Natriumacetat für eine Stunde bei minus 80 Grad Celsius hergestellt wurden, Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe mit maximaler Geschwindigkeit für eine Stunde bei vier Grad Celsius.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet zweimal mit 500 Mikrolitern 70% Ethanol waschen. Nach der zweiten Wäsche das Pellet in zwei Mikrolitern 100%Formamid wieder aufsetzen und die Sonde 30 Minuten bei 40 Grad Celsius schütteln, bevor sie ein gleiches Volumen von 4X Saline-Natriumcitrat in 20%dextran Sulfat hinzufügen. Zur Fixierung vor der Behandlung und Permeabilisierung von kleinen Zellen mit kleinen Kernen und einer geringen Menge an Zytoplasma, fügen Sie zunächst zwei Mal 10 zu den sechsten Zellen in 200 Mikroliter PBS direkt auf Glasabdeckungen in einzelnen Brunnen einer 24-Well-Platte und lassen Sie die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu begleichen.
Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie schnell die PBS durch 300 Mikroliter frisch zubereitet 4%Paraformaldehyd ergänzt mit 0,1%Tween 20. Nach 10 Minuten die festen Zellen dreimal in 300 Mikrolitern 0,05%TPBS für fünf Minuten pro Waschgang bei Raumtemperatur waschen. Nach der letzten Wäsche die T-Zellen mit 300 Mikrolitern 0,5%TPBS 10 Minuten bei Raumtemperatur durchpermebilisieren, bevor die Zellen mit 250 Mikrolitern pro Brunnen DES RNAse-Cocktails 1:100 in PBS für eine Stunde bei 37 Grad Celsius verdünnt werden.
Am Ende der Inkubation spülen Sie die Zellen in 300 Mikroliter PBS ab und fügen Sie 300 Mikroliter 20%Glycerin in PBS zu jedem Brunnen mit einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu. Am nächsten Morgen das Glas für 15 bis 30 Sekunden auf Trockeneis legen, um die Zellen einzufrieren, bevor sie die Proben nach und nach bei Raumtemperatur auftauen und 30 Sekunden lang in 300 Mikroliter von 20% Glycerin in PBS einweichen. Nach dem Einfrieren/Auftauen der Zellen drei weitere Male, wie gerade gezeigt, waschen Sie die Proben in 300 Mikroliter von 0,5%TPBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei Wäschen in 300 Mikrolitern von 0,05%TPBS für fünf Minuten pro Wäsche bei Raumtemperatur.
Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 300 Mikrolitern 0,1 normaler Salzsäure 12 Minuten bei Raumtemperatur behandeln, gefolgt von zwei Spülungen in 300 Mikroliter Salznatriumcitrat. Dann fixieren Sie die Proben über Nacht in 300 Mikroliter 50%Formamid in 2X satiniertem Natriumcitrat bei Raumtemperatur. Zur Fixierung, Vorbehandlung und Permeabilisierung großer Zellen mit einer hohen Menge an Zytoplasma, fixieren, vorbehandeln und permeabilisieren die Zellen ähnlich wie bei menschlichen primären T-Zellen gezeigt und behandeln die Proben mit 300 Mikrolitern 0,0025%Pepsin in 0,01 normaler Salzsäure für ein paar Sekunden bis zu fünf Minuten.
Beobachten Sie die Zellen unter einem optischen Mikroskop und stoppen Sie die Reaktion mit zwei fünfminütigen Wälwaseln in 300 Mikrolitern 50 Millimolar Magnesiumchlorid, sobald die Kerne frei vom Zytoplasma sind, aber die Nukleoli noch sichtbar und intakt sind. Für 3D-Multicolor-DNA-FISH denaturieren die Hybridisierungssonden fünf Minuten lang bei 80 Grad Celsius und legen die Sonden sofort auf Eis. Legen Sie die Sonden auf einen sauberen Mikroskopschlitten und legen Sie einen Deckelrutsch von Zellen auf jeden Tropfen der Sonde.
Versiegeln Sie die Abdeckungsrutschkanten mit Gummizement. Wenn der Zement vollständig getrocknet ist, denaturieren Sie die Proben auf einem 75 Grad Celsius Heizblock. Nach vier Minuten die Proben bei 37 Grad Celsius über Nacht in einer metallischen Box, die in einem Wasserbad schwimmt, hydridisieren.
Am nächsten Morgen den Gummizement abziehen und mit den in 2X-Saline-Natriumcitrat getauchten Rutschen vorsichtig die Abdeckungen abziehen. Legen Sie jeden Deckel in einzelne Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit zwei Millilitern frischem kochhaltigem Natriumcitrat pro Brunnen für zwei fünfminütige Wärungen bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 90 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Inkubation die Deckellipsen kurz in zwei Milliliter von 0,2%Tween 20 in 4X Kochsaline-Natriumcitrat abspülen.
Für den 3D-Multicolor-DNA-FISH-Nachweis übertragen Sie die Abdeckungen in einzelne Brunnen einer neuen 24-Well-Platte und blockieren jede unspezifische Bindung in 300 Mikroliter Blockierpuffer für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 20 Umdrehungen pro Minute. Behandeln Sie die Proben am Ende der Inkubation mit der entsprechenden Konzentration von Antidigoxigenin und/oder Streptavidin, das im Sperrpuffer 35 Minuten lang in einer dunklen und nassen Kammer bei 37 Grad Celsius verdünnt wird. Am Ende der Inkubation die Proben in einzelne Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte übertragen und die Proben dreimal in zwei Millilitern von 0,2%Tween 20 und 4X Kochchen-Natriumcitrat für fünf Minuten pro Wäsche mit Schütteln bei 90 Umdrehungen pro Minute waschen.
Nach der letzten Wäsche die Proben in zwei Milliliter PBS ausdemieren, bevor sie die Abdeckungen auf eine neue 24-Well-Platte zur Nachfixierung in 300 Mikroliter n. 2%Formaldehyd in PBS pro Brunnen für zwei Minuten bei Raumtemperatur übertragen. Waschen Sie die festen Zellen fünfmal kurz in 300 Mikroliter PBS, gefolgt von einer Färbung mit DAPI, die mit einem Nanogramm pro Milliliter in 300 Mikroliter PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur verdünnt wird. Waschen Sie die Abdeckungen fünfmal in PBS und montieren Sie die Proben mit einem geeigneten Montagemedium.
Dann erfassen Sie 3D-Bilder mit einem Mikroskopsystem. 3D-Multicolor-DNA-FISH ermöglicht die zeitgemäße Visualisierung verschiedener genomischer Loci innerhalb konservierter 3D-Kerne. Für die DNA-Sondenvorbereitung sorgt eine Sondengröße von weniger als 200 Basenpaaren für ein erfolgreiches 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Verfahren.
Suboptimale DNA-FISH-Sonden, die durch Nick-Übersetzung erzeugt werden, können teilweise oder überdacht werden. Überverdaut werden Sonden aufgrund eines Verlusts an Spezifität in der Hybridisierung und einer daraus resultierenden Zunahme des Hintergrunds zu einem unspezifischen Signal führen. Für humane primäre T-Lymphozyten und kleine Zellen mit kleinen Kernen und einer geringen Menge an Zytoplasma wird eine 12-minütige 0,1-normale Salzsäurebehandlung empfohlen, um den Zugang der Kerne zu den DNA-Sonden zu fördern und die nukleare Integrität zu wahren.
Zytoplasmatische Pepsin-Verdauung ist nicht erforderlich, um ein DNA FISH gutes Signal in kleinen Zellen zu erhalten. Für menschliche primäre Myoblasten und Zellen, die große Kerne und reichlich Zytoplasma haben, ist der Pepsinisierungsschritt jedoch von grundlegender Bedeutung. Eine kurze und suboptimale Zytoskelett-Pepsinisierung wird den Eintritt der Sonde in die Kerne behindern, die ohne EIN DNA-FISH-Signal endet.
Wenn die Zellen jedoch überpepsinisiert sind, bleiben die Kerne nicht intakt und verlieren ihre 3D-Struktur. Ein erfolgreicher 3D-Mehrfarben-DNA-FISH führt zum Vorhandensein von Signalen innerhalb der Kerne. Ich schlage vor, mit frischem biologischem Material zu arbeiten, Sonden zu testen, bevor sie den 3D-Mehrfarben-DNA-FISCH durchführen, frische Lösungen vorbereiten und bei Inkubationszeiten und Temperaturen präzise sein.
Denken Sie daran, dass Formamid und HCL gefährliche Stoffe sind und immer in einer chemischen Rauchhaube mit geeigneten Einwegmaterialien verwendet werden sollten.
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