Immunology and Infection
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प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क की प्लांटा पहचान में टर्बोआईडी-आधारित निकटता लेबलिंग
Summary May 17th, 2020
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यहां वर्णित निकोतियाना बेंथमियाना पत्ती ऊतक में एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर के टीआईआर डोमेन के इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान के लिए एक निकटता लेबलिंग विधि है। निकोतियाना और अन्य पौधों की प्रजातियों में इस तकनीक का उपयोग करके ब्याज के अन्य प्रोटीन के बीच बातचीत की पहचान के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान किया गया है।
Transcript
एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स विभिन्न रोगजनकों के खिलाफ संयंत्र रक्षा मध्यस्थता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हम टोल/इंटरल्यूकिन-1 रिसेप्टर डोमेन के इंटरप्लेस भागीदारों की पहचान के लिए टर्बोड आधारित निकटता लेबलिंग विधि का वर्णन करते हैं जिसमें एनएलआरएस जैसे निकोटियाना बेंथामियाना संयंत्रों में प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स होते हैं । यह प्रोटोकॉल अन्य पौधों की प्रजातियों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण संदर्भ प्रदान करता है और इसे निकोटियाना बेंथामियाना में रुचि के किसी भी प्रोटीन तक बढ़ाया जा सकता है।
टर्बोआईडी आधारित निकटता लेबलिंग दृष्टिकोण का पारंपरिक दृष्टिकोणों पर एक अलग लाभ है क्योंकि इसका उपयोग वीवो में क्षणिक या कमजोर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को कैप्चर करने के लिए किया जा सकता है। उच्च घनत्व पर गीली मिट्टी में एन बेंथामियाना बीज उगाकर शुरू करें। उन्हें 18 घंटे की रोशनी और आठ घंटे की डार्क फोटो पीरियड के साथ जलवायु कक्ष में 23 से 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें ।
पौधों को लगभग चार सप्ताह तक कक्ष में रखें जब तक कि वे बाद में कृषि के लिए चार से आठ के पत्ते के चरण तक न बढ़ें। टर्बोआईडी संलयन का निर्माण करें और प्लाज्मिड को एग्रोबैक्टीरियम टमेफैपियंस सक्षम कोशिकाओं में बदल दें जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित है। पूरी तरह से परिपक्व एन बेंथामियाना पत्तियों के अक्षांत एपिडर्मिस के इनोकुलम में घुसपैठ करने के लिए एक मिलीलीटर सुईलेस सिरिंज का उपयोग करें।
छानने के बाद 36 घंटे में, पत्तियों में 200 माइक्रोमोलर बायोटिन में घुसपैठ करें और पत्तियों के ऊतकों की कटाई से पहले अतिरिक्त तीन से 12 घंटे के लिए पौधे को बनाए रखें। पत्ती का नमूना एकत्र करने के लिए, पेटियोल के आधार पर घुसपैठ की पत्तियों को काटें, पत्तियों की नस को हटा दें, और तरल नाइट्रोजन में ऊतक को फ्लैश करें। पत्ती के ऊतकों को मूसल और मोर्टार के साथ पीसें और पाउडर को 15 या 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
कुल प्रोटीन निकालने के लिए, एक दो मिलीलीटर ट्यूब में लगभग 0.35 ग्राम पत्ती पाउडर स्थानांतरित करें। इस प्रक्रिया के दौरान तरल नाइट्रोजन में कम तापमान पर ऊतक को बनाए रखना सुनिश्चित करें। पाउडर में रिपा लाइसिस बफर के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें।
भंवर ट्यूब 10 मिनट के लिए और 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना छोड़ दें, ट्यूबों को उलटा करके हर चार से पांच मिनट में सामग्री को मिलाकर। 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 20, 000 बार जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र । इसके बाद सुपरनिटेंट इकट्ठा करें।
डिसल्टिंग कॉलम के जरिए सैंपल चलाकर फ्री बायोटिन निकालें। कॉलम के नीचे सीलर निकालें और इसे 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। फिर टोपी को ढीला करें और कॉलम को 1, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब में डीसल्टिंग कॉलम रखें और कॉलम को तीन बार रिपा लाइसिस बफर के पांच मिलीलीटर के साथ बराबर रखें। इसे 1, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें और प्रवाह को हर बार त्याग दें। समतुल्य कॉलम में राल के शीर्ष पर 1.5 मिलीलीटर प्रोटीन निकालें जोड़ें।
और जब अर्क राल में प्रवेश करती है, तो रिपा लाइसिस बफर के एक और 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। दो मिनट के लिए कॉलम अपकेंद्रित्र और आगे का उपयोग करने तक बर्फ पर desalted नमूनों छोड़ दें । डिसाल्टेड प्रोटीन अर्क की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बायो-रेड स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके OD595 को मापें।
ढाल बीएसए समाधान के मूल्य के आधार पर मानक वक्र ड्रा और desalted प्रोटीन नमूनों की एकाग्रता की गणना। कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए रिपा लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर के साथ स्ट्रेप्टाविडिन C1 संयुग्मित चुंबकीय मोतियों को बराबर करें। तीन मिनट के लिए मोतियों को अवशोषित करने के लिए चुंबकीय रैक का उपयोग करें और धीरे से समाधान को aspirate।
फिर एक बार और धोएं। प्रोटीन निकालने को समतुलित चुंबकीय मोतियों में स्थानांतरित करें और प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक रोटेटर पर रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, एक चुंबकीय रैक के साथ मोतियों पर कब्जा करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
इसके बाद, मोतियों को 1.7 मिलीलीटर धोने वाले बफर के साथ इसे ट्यूब में जोड़कर धोएं और इसे आठ मिनट के लिए रोटर पर इनक्यूबेट करें। पहले वर्णित सुपरनेट को हटा दें और 1.7 मिलीलीटर वॉश बफर टू के साथ धोएं और बफर थ्री धोएं। डिटर्जेंट को हटाने के लिए 50 मिलीमोलर ट्राइस एचसीएल के 1.7 मिलीलीटर जोड़ें।
इसके बाद ट्यूब को मैग्नेटिक रैक पर रखें और सुपरनेट निकाल दें। 50 मिलीमोलर ट्राइस एचसीएल के एक मिलीलीटर के साथ धो दोहराएं और मोतियों को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंत में, मोतियों को 50 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर के साथ पांच मिनट प्रति वॉश के लिए छह बार धोएं।
बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन के संवर्धन की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए मोतियों के 100 माइक्रोलीटर का उपयोग करें और शेष नमूने को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए फ्लैश फ्रीज करें। पश्चिमी ब्लॉट्स का उपयोग एग्रोइनफिलट्रेल्ड एन बेंथामियाना पत्तियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति और बायोटिनाइलेशन का विश्लेषण करने के लिए किया जाता था। घुसपैठ की पत्तियों में बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन को बाद में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए स्ट्रेप्टाविडिन C1 संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ कुशलतापूर्वक समृद्ध किया गया था।
विभिन्न आकारों के साथ विभिन्न प्रोटीन पर कब्जा कर लिया गया और समृद्ध प्रोटीन के पश्चिमी दाग विश्लेषण गंदा बैंड दिखाया । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, कृपया डेसालिंग कॉलम के तल पर सीलर को हटाना याद रखें और प्रत्येक अपकेंद्रित्र से पहले टोपियां ढीला करें। यह प्रोटोकॉल निकोटियाना बेंथामियाना में रुचि के अन्य प्रोटीन के लिए आसानी से अनुकूलनीय है और इसका उपयोग अन्य पौधों की प्रजातियों में टर्बोआईडी पीएल का विस्तार करने के लिए भी किया जा सकता है।
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