Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Agrobacterium-Mediert Immature Embryo Transformasjon av Recalcitrant Maize Innavlede linjer ved hjelp av morfonisk gener
Chapters
Summary February 14th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Plante morfonisk gener kan brukes til å forbedre genetisk transformasjon av recalcitrant genotyper. Beskrevet her er en Agrobacterium-mediertgenetisk transformasjon (QuickCorn) protokoll for tre viktige offentlige mais innavlede linjer.
Transcript
De fleste mais innavlede linjer kan ikke genetisk forvandles ved hjelp av konvensjonelle transformasjonsprotokoller. Her beskriver vi en QuickCorn transformasjonsmetode som er rask og mindre genotypeavhengig. QuickCorn-metoden benytter maistranskripsjonsfaktorer BABY BOOM og WUSCHEL.
Når de innlemmes i transformasjonsvektorsystemet, fungerer disse genene synergisk for å stimulere embryogen vekst. I motsetning til konvensjonelle maistransformasjonsprotokoller involverer QuickCorn-metoden ikke et callusinduksjonstrinn under transformasjon. T-DNA-regionen til den binære vektoren som brukes i vårt arbeid inneholder tre viktige komponenter, morfogene gener, markørgener og cre/loxP-rekombinasjonssystemet.
Det varmeinduserte cre/loxP-rekombinasjonssystemet ble inkludert i T-DNA for å fjerne morfogene gener fra maisgenomet for å tillate normal callusregenerering i planteutvikling. Omtrent to til tre dager etter silke har dukket opp, og hvis pollen vil være tilgjengelig neste dag, kutte silke og skall med 70% etanol-sterilisert saks, omtrent 2 1 /2 centimeter under enden av skallet blader, hvor silke dukker opp, og dekke silke med en skytepose. Når anthers kommer fra en dusk, dekk dusken med en duskpose, og legg en ikke-skliet binders ved foten av posen rundt stilken.
Morgenen etter å ha plassert duskposen, bøy planten forsiktig, og bank posen for å oppmuntre pollen til å bli utgitt. Fjern deretter duskposen, og brett toppen av posen over for å hindre pollen fra å rømme. For å pollinere en mottaker plante, eksponere silke, og raskt helle pollen fra dusk posen på silke.
Dekk umiddelbart det pollinerte øret med duskposen, og fest bunnen av posen rundt stilken med stifter. For å sjekke den umodne embryostørrelsen, ni til 12 dager etter pollinering, trekk forsiktig ned skallet for å eksponere kjernene på ca 1/3 til 1/4 av omkretsen av øret og ca 1/3 av avstanden ned øret. Bruk en skalpell til å skjære av hetten på en enkelt kjerne som ligner på de fleste andre kjerner i størrelse og farge, og bruk en slikkepott med en linjal for å trekke ut embryoet.
Bruk deretter linjalen eller en kaliper til å måle lengden på embryoet. Innen en til fire dager etter høsting, fjern skall og silke fra høstede ører, og sett inn et passende håndtak i toppen eller bunnen av hvert øre. Senk ørene ned i en stor beholder med desinfeksjonsblekemiddelløsning i en steril laminær strømningshette med håndtaket vendt opp.
Etter 20 minutter, skyll ørene tre ganger med et sjenerøst volum friskt sterilt destillert vann i fem minutter per vask før ørene tørker i flere minutter. Deretter fyller du ett to milliliter mikrocentrifugerør per øre med 700A flytende medium, og bruker en steril skalpell for å fjerne den øverste til to millimeter av hver kjernekrone for å avsløre ørets endsperm. Finn det umodne embryoet i kjernen på siden mot spissen av øret, nær vedlegget til cob.
For toppbehandler og høyrehendte operatører hviler du øret på en stor steril petriskål, og sett en mikrospatel inn i endsperm i perikarp lengst borte fra embryoet. Vri forsiktig oppover for å løsne endperm og å utsette embryoet, og bruk slikkepotten til å forsiktig plassere embryoet i ett rør på 700A flytende medium. For base handler operatører holder øret med venstre hånd, sett en mikro slikkepott inn i endsperm i perikarp lengst bort fra embryoet, og forsiktig vri oppover for å løsne endperm.
For å dyrke embryoene i en Agrobacterium suspensjon kultur, samle bakterier fra en nylaget arbeidsplate i 10 milliliter av 700A flytende medium, og virvel for å suspendere bakteriekulturen helt. Mål den optiske tettheten ved en bølgelengde på 550 nanometer, og vask embryoene med en milliliter frisk 700A medium. Dypp embryoene i en milliliter Agrobacterium suspensjon, og vortex på en lav innstilling i 30 sekunder.
Sett embryoene på benken med rørene i horisontal orientering i fem minutter før du overfører hele innholdet i hvert rør til individuelle plater av 562V co-dyrkingsmedium. Virvle platene forsiktig for å fordele embryoene jevnt, og aspirere overflødig Agrobacterium suspensjon. Orienter embryoene forsiktig med den kuppelformede siden vendt opp, og ta vare på å unngå å skade embryoene.
Legg deretter plater i plastbokser for en overnattingsinkubasjon ved 21 grader Celsius i mørket. Neste morgen, nøye overføre infiserte embryoer til hvile medium 605T, plasser ca 30 embryoer per plate, scutellum side opp, for en fire-til 10-dagers inkubasjon ved 26 grader Celsius i mørket. På rundt syv dager kan somatisk embryoutvikling observeres på overflaten av zygotisk scutellum.
På slutten av hvileperioden plasserer du boksen med embryoer i en 45-graders Celsius-inkubator med 70% relativ fuktighet i to timer, etterfulgt av en en-til-to-timers inkubasjon ved 26 grader Celsius i mørket. På slutten av inkubasjonen, plasser 10 til 15 varmesjokkerte umodne embryoer på individuelle plater av skyteformasjonsmedium supplert med 05 milligram per liter ugressmiddel imazapyr som et selektivt middel. Fjern forsiktig eventuelle coleoptiles etter behov, og returner embryoene til 26-graders Celsius mørk inkubator i to uker.
På slutten av inkubasjonen, overfør omtrent åtte stykker vev per plate på rooting medium plater for en en-til-to-ukers inkubasjon med 16 timer med lys og åtte timer med mørke ved 27 grader Celsius. Etter hvert som plantene utvikler seg, plasserer du en sterkere plantelett som inneholder både skudd og kraftige røtter på individuelle plater av rotingsmedium under lys i ytterligere syv til 14 dager. Tillat skudd som ikke er fullt utviklet for å bli inkubert på samme medium i en annen til to uker før de er klare til å bli flyttet til jord.
Etter hvert som planten blir mer energisk, skyll røttene med vann fra springen for å fjerne agar. Deretter transplanterer de enkelte plantene i tre-tommers potter som inneholder et forhåndsfuktet jordløst substrat i et brett med dreneringshull, og legg brettet i et vekstkammer med eller uten en plastfuktighetkuppel. Ni til 14 dager etter pot overføring, transplantere hver plantlet med jord i en 1,5-gallon pott.
Legg til en kontrollert frigivelsegjødsel til potten, og vedlikehold plantene i drivhuset. Når øreskudd begynner å dukke opp fra anlegget, bruk en halvgjennomsiktig skytepose for å dekke skuddene slik at de nye silkeene kan observeres uten å fjerne posen. Deretter pollinerer plantene på riktig utviklingsstadium som demonstrert.
Maisørene høstes vanligvis ni til 12 dager etter pollinering. Umodne embryoer med lengder mellom 1,5 og to millimeter er de beste explants for transformasjon for denne protokollen. Åtte dager etter infeksjon kan ZsGreen-uttrykkende somatiske embryoer visualiseres ved fluorescensmikroskopi.
Varmebehandling åtte dager etter infeksjon induserer cre recombinase uttrykk, noe som resulterer i utskjæring av morfogen genet, cre, og ZsGreen uttrykk kassetter flankert mellom de to loxP nettsteder. Etter tre til fire uker med kultur på skyteformasjonsmediet som inneholder ugressmiddel, kan det observeres voksende vev med modning av embryoer eller skyte knopper som er resistente mot ugressmidlet. Noen av ugressmiddelresistente vev kan være negative for ZsGreen, noe som tyder på at cre-mediert eksisjon sannsynligvis skjedde i disse vevene.
Etter å ha flyttet vevet til rooting medium og lett inkubasjon, kan sunne, kraftige, voksende skudd med velutviklede røtter høstes. Merk at noen vev kan synes å ha flere skudd muligens på grunn av kloniske planter som har identiske transgene integrasjon mønstre. QuickCorn-metoden kan i stor grad forbedre maistransformasjonseffektiviteten og utvide listen over transformerbare genotyper.
Protokollen kan reproduseres av forskere med minimum maistransformasjonstrening. Ved hjelp av QuickCorn-metoden bør rotfestede planter være klare til å overføre til jord på bare fem til syv uker etter infeksjonsdagen. Vær oppmerksom på medium sammensetning, tidspunktet for subkulturer, og temperatur og lysforhold.
Kvaliteten på startmaterialene er også avgjørende for vellykket transformasjon. Kjemikaliene, blekemiddelløsningen og ugressmiddelet som brukes i denne protokollen, er biofarlige. Pass på at du bruker riktig personlig verneutstyr under bruk.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
