Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Hayley Abbiss; Joel  P. A. Gummer; Michael Francki; Robert  D. Trengove

doi:10.3791/60851

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Biochemistry

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无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析

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07:10 min

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March 13, 2020

DOI:

10.3791/60851-v

DOI:

10.3791/60851-v

•

07:10 min

March 13, 2020

•

8 Views

Hayley Abbiss^1,2,3, Joel P. A. Gummer^1,4, Michael Francki^5,6, Robert D. Trengove¹

¹Research and Innovation,Murdoch University, ²Centre for Digital Agriculture,Curtin University, ³Centre for Integrative Metabolomics and Computational Biology, School of Science,Edith Cowan University, ⁴Centre for Computational and System Medicine, Health Futures Institute,Murdoch University, ⁵Department of Primary Industries and Regional Development, ⁶State Agricultural Biotechnology Centre,Murdoch University

Transcript

代谢物受基因组环境和管理实践等因素影响。了解这些因素之间的相互作用可以更准确地预测和管理产品的产量和质量。通过结合第三个移动相，而不是传统的两个，该技术允许分离和检测更广泛的代谢物。

代谢组学可应用于生物学的任何领域。首先，对生物体的生物化学有更深入的了解，帮助解释它们对与生理学有关的非生物或生物应激的反应。其次，将生物标志物与研究的扰动性联系在一起。

由于异丙醇是一种粘性溶剂，因此应在低耀斑速率下引入，在将组合物增加至 98% 之前应使用足够的平衡时间。要开始制备谷物，请使用实验室搅拌机研磨谷物。高速运行搅拌机 20 秒，然后重复。

从底座上拆下搅拌机罐。点击搅拌杯的侧面，将任何粗糙的颗粒带到样品表面。粗糙的颗粒可以丢弃或存储。

将细磨颗粒从搅拌机转移到两毫升塑料微型离心管。在萃取的同一天，准备萃取溶剂，如手稿中所述。接下来，将200毫克细磨颗粒放入两毫升微型离心管中。

在管中的颗粒中加入500微升萃取溶剂。此外，通过向空管中加入 500 微升萃取溶剂来准备空白。使用均质器，设置为 6，500 RPM，混合溶剂和颗粒 20 秒。

然后，再重复20秒。然后，在摄氏四度和16，100倍G下将管离心5分钟。将上一液转移到两毫升塑料管中，并保留颗粒。

在颗粒上重复两次提取过程。将三种超自然剂混合，产生约1.5毫升的总萃取量，通过涡流混合。要对用于质量控制的所有谷物提取物进行一个集合样本，请将每个谷物提取物的 55 微升转移到两毫升管和涡流中。

然后，将该池样品的 50 微升等分转移到玻璃瓶中。将每个颗粒样品提取物的 50 微升等分转移到玻璃瓶中。如书面手稿所述，准备液相色谱质谱法所需的解决方案。

在 LCMS 分析的当天，准备 100 毫升 5%乙酰丙酸，每毫升亮氨酸素含有 200 毫微克。将 950 微升溶液添加到含有 50 微升等分的谷物提取物的玻璃小瓶中。通过涡流混合小瓶中的内容物。

首先，按照手稿和制造商的用户指南，设置校准仪器。接下来，使用LCMS级溶剂（包括移动相和洗涤溶剂）清洗和冲洗LC流体系统。使用 LC 方法启动条件平衡 LC 系统，确保柱压稳定。

设置仪器序列表。在样品序列的开头注射甲酸钠以检查仪器校准。首先分析溶剂和制备空白，然后对系统调节进行集中质量控制样品，然后进行随机抽样列表。

随着技术复制的定期运行质量控制样本。在序列的末尾运行两个质量控制样本。在序列运行时，检查数据质量，包括内部标准质量精度和信号可重复性。

要检查信号的可重复性，对叠加光谱的目视检查就足够了。用于准备谷物提取物的解决方案中包括了四个内部标准。在LCMS期间，对正负电离模式均观察到了良好的质量精度和内部标准的单一可重复性。

根据对空白的分析，判断负模中的421个信号和正模中的835个信号是伪影。这些信号以等于或大于粒样品中平均单强度 5% 的强度的空白出现。删除伪影和进一步筛选数据后，负模式返回 483 个功能，正模式返回 523 个功能。

大约250个特征与生物学有关，而且小麦品种的强度差异很大。质量控制措施（如包含准备空白、内部标准和集合样本）在此协议中非常重要。

Summary

提出了一种对小麦粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该协议包括醋酸代谢物提取方法和反向相液色谱-质谱方法，在正负电喷雾电相成像模式下采集。

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Untargeted Liquid Chromatography Mass Spectrometry Metabolomics Wheat Grain Metabolites Genome Environment Management Practices Analytical Column Extraction Solvent Preparation Protocol Coarsely-ground Grain Finely-ground Grain Homogenizer Centrifuge Supernatant Quality Control

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