A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Optimalisering av renal organoid og organotypisk kultur for vaskularisering, utvidet utvikling og forbedret mikroskopiavbildning
Chapters
Summary March 28th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette arbeidet beskriver to metoder for å studere organutvikling, et forbedret xenotransplantasjonsoppsett på chorioallantoic membran (CAM) fra fugleembryoer som gjør det mulig for vaskularisering av kultiverte embryonale organer og organoider og en ny fast z-retning organkulturmetode med modifiserte eksperimentelle forhold som gjør det mulig å høyoppløsnings tidsforløp konfokal avbildning.
Transcript
Nyreorgankultur og organeller som er avledet fra programmerte stamceller gir gode måter å studere mekanismer bak nyreutvikling og sykdom. Det nåværende organkultursystemet gir imidlertid ikke blodstrømmen til nyrene. På grunn av dette er årsaken til at de nåværende modellene er ufullstendige og ikke klarer å rekafulere nyrenes hovedfunksjon, som er blodfiltrering.
I denne publikasjonen presenterer vi en forbedret protokoll for dyrking og visualisering av embryonyrer og organoider på den chorioallantoic membranen av kyllingembryo. I vår nye eksperimentelle oppsett, vi overlegg nyre rudiments transplantert på CAM med gjennomtrengelige betyr reservoarer som er fylt med kultur medium. Denne protokollen øker betydelig overlevelsen av nyre rudiments og også de iboende endotelceller.
Metoden gjør det mulig å strømme til de utviklende glomerulus. Nylig publiserte vi også en ny fast sett retning organ kultur metode som tilbyr høy oppløsning confocal 3D time-lapse imaging. Metoden ga optimale forhold for langsiktig konfokal avbildning av organoider og organ rudiments.
I tilnærmingen komprimerer vi forsiktig vevet mellom et glassdeksel og en gjennomtrengelig membran. Her viser vi hvordan de spesialdesignede platene er laget og hvordan kultureksperimentene er satt opp. I denne publikasjonen presenterer vi dermed en forbedret nyreorganellerørkulturteknikk.
Denne metoden gir en bedre måte å modellere organelle genesis og gjennomføre høyoppløselig bildebehandling for å studere embryonale nyrer og nyre organoider ex vivo. Avhengig av eksperimentet ta overføring celle contra-inserts designet for seks-godt eller 12-brønner plater. Skjær ned sidene av innsatsen ved hjelp av et Dremel-verktøy for å lage en to millimeter høy plastring med en gjennomtrengelig membran festet til den.
Poler kantene på ringen fra swarf med en skalpell eller en skarp kniv. Steriliser minireservoarene i 70 % etanol i minst én time. Vask deretter minireservoarene i autoklav ved destillert vann og tørk dem i en laminær hette.
Skyll minireservoarene i PBS og kulturmedium. Plasser reservoaret på en petriskål på toppen av vår dråpe kulturmedium med membranen vendt oppover. Ordne dissekert ex vivo embryonale nyrer eller nyre organoider på membranen.
Unngå å etterlate mye væske rundt prøvene og la dem være festet fra to til 24 timer i en cellekultur inkubator. Eksenal transplantasjon er gjort til chorioallantoic membran av åtte-dagers gamle ex ovo embryonisk kylling. Overfør minireservoarene slik at membranen dekker transplantatet.
Plasser dem i periferien av CAM slik at de ikke dekker embryoet. Deretter legger kultur medium til mini reservoarer. Dyrg prøvene på kylling CAM i ni dager som maksimum.
Bytt kulturmediet i minireservoarene daglig. Vaskularisering av prøvene kan observeres allerede 24 til 48 timer etter transplantasjon. For å lage de spesialdesignede seksbrønnsplatene for den faste kulturen.
Du må starte med å bore 20 millimeter hull i bunnen av platen ved hjelp av en boremaskin med en egnet borkrone. Deretter polerer felgene på hullene på oversiden av platen. Til slutt steriliser platene i 70% etanol i minst en time.
Vask deretter platene i autoklav ved destillert vann og tørk dem i lemiar hette. Vask 22x22 millimeter dekselet glir i 70% etanol og la dem tørke helt. Lim dekselet slip på toppen av et hull i bunnen av en brønn ved hjelp av vev lim.
Etter tørking, inspiser platene under sterilt mikroskop og fjern overflødig lim. Bland først en aliquot av polystyrenperler med like volum hydrogen. Plasser transfillinnsatsen under et dissekeringsmikroskop med membran vendt opp og ordne nyrene på membranen.
Tilsett en dråpe hydro-gel perle blanding ved siden av nyrene nøye. Vend transfillinnsatsen slik at membranen og nyrene vender ned. Plasser deretter innsatsen forsiktig i vår brønn med spesialdesignet seksbrønns plate.
Skyv innsatsen veldig forsiktig inn i brønnen. Følg graden av utflating fra mikroskopet til nyrene er på nivå med perlene. Hold innsatsen litt presset til brønnen med en hånd og fest den til platen ved å smelte plast på tre punkter i periferien av innsatsen med et loddejern.
Legg to milliliter kulturmedium inn i brønnen gjennom en åpning på siden. Når du starter en tidsforløpsbilde, overfør platen til inubatoren på scenen til et omvendt mikroskop. Vår modifiserte CAM-fangstprotokoll muliggjør svært effektiv vaskularisering av nyreorganoider og embryonale nyrer.
Mange reservoarer som inneholder kulturmediet leverer donorvev og beskytter det mot tørking i den første perioden som fortsetter vaskulærtizaton. Denne filmen viser strømmen av kylling blodlegemer i en embryonal mus nyre senter podet til kylling CAM og dyrket i syv dager. Dette figurpanelet viser at vår forbedrede CAM-kulturmetode gir tillatte forhold for nyreavledede endotelceller.
Figur A og B viser embryonale nyrer dyrket i fem dager på dager intervallkultur ble sentrum podet til kylling CAM i fem dager. Farging med musespesifikke CD-31 antistoff viser at endotelcellenettverket til nyresenteret podet til CAM er mer omfattende enn i venstre sidekontroll. I figuren C ser vi at mus blodkar farget med mus spesifikke CD-31 antistoff og det er mest med kylling blodkar.
Figur D og E viser kryoseksjoner av mus embryonale nyrer dyrket på reisekultur eller kylling CAM i fem dager og farget med CD-31 og Hoechst. Glomeruli vaskulaturen er mer moden i nyrer dyrket på kylling CAM enn i kontrollkulturer. Figur F viser en mus embryonisk nyre dyrket på CAM av en transgen GFP kylling i syv dager.
Musen endotelceller er farget med CD-31 antistoff, og vi kan observere at vaskulaturen i xenotransplanted mus nyrer er for det meste, men ikke utelukkende mus avledet. Romanen fast sett retning kultur gjør det mulig å dyrke embryonale nyrer og organoider i begrenset avstand. I en tradisjonell reisekultur plasseres de kultiverte organene på et filter som holdes i et luftmediumgrensesnitt av et metallnett.
Denne metoden gir gode forhold for utvikling og vekst, men er ikke optimal for bildebehandling. I den faste retningskulturen presses det kultiverte organet mellom en glassbunn av parabolen og en membran, og tykkelsen på den styres av polystyrenperlene som fungerer som avstandsslysere her. De utviklende organene kan avbildes rett gjennom dekkglasset som gir bedre syn på orgelet.
Dette figurpanelet viser at embryonale nyrer og nyreorganoider kan dyrkes i den faste retningskulturmetoden. Lyse feltbilder av embryonale nyrer og nyreorganoider på dag sju viser normal utvikling. I figuren C, GFB uttrykk har blitt aktivert i utviklingen nephrons av en nyre organoid av figur D viser en nyre med traumer en farging på euretric knopp og seks to farging merking nephron forløperceller.
Tallene E og F presenterer musen nyre dyrket i 12 dager. Traumene en og nephron farging viser eurethric knopp og podocites. Filmen presenterer også en embryonisk nyre av MTMG, Taiwan cree opprinnelse, hvor Taiwan cree induserer GFB uttrykk i endotelceller.
Vi kan se at nyre endotelcellene er tilstede i den utviklende embryonale nyren, og endotelnettverket kan også utvikle seg i kulturmetoden. I panelet til høyre kan du se hvordan endotelceller migrerer inn i den vaskulære kløften til en S-formet scene nephron. Her har vi presentert den forbedrede protokollen for xenotransplantasjon av nyreorganoider og embryonale nyrer til kylling CAM.
Denne protokollen øker betydelig overlevelsen av nyre rudiments og også deres iboende endotelceller. Metoden gjør det mulig å strømme til de utviklende glomerulus. Den andre protokollen som presenteres her er den faste sett retning organ kultur metode som forbedrer bildekvaliteten og bidrar til å studere organelle genese på enkeltcellenivå.
Høyoppløselige bilder er egnet for automatisert cellesegmentering og databasert studie av cellulær atferd i nyreorganoider og nyrekulturer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
