A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo's die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.
Transcript
Nierorgaancultuur en organellen die zijn afgeleid van geprogrammeerde stamcellen bieden uitstekende manieren om mechanismen achter nierontwikkeling en -ziekte te bestuderen. Het huidige orgaancultuursysteem zorgt echter niet voor een bloedtoevoer naar de nier. Als gevolg van deze reden zijn de huidige modellen onvolledig en slagen er niet in om de belangrijkste functie van de nier samen te vatten, namelijk bloedfiltratie.
In deze publicatie presenteren we een verbeterd protocol voor de teelt en visualisatie van embryonieren en organoïden op het chorioallantoïsche membraan van kippenembryo. In onze nieuwe experimentele set-up bedekken we de nierbeginselen die op CAM zijn getransplanteerd met doorlatende betekenis reservoirs die gevuld zijn met cultuurmedium. Dit protocol verhoogt aanzienlijk de overleving van nier rudiments en ook de intrinsieke endotheelcellen.
De methode maakt de bloedtoevoer naar de zich ontwikkelende glomerulus. Onlangs publiceerden we ook een nieuwe vaste set richting orgelcultuur methode die hoge resolutie confocale 3D time-lapse imaging biedt. De methode voorzag in optimale omstandigheden voor confocale beeldvorming op lange termijn van de organoïden en orgaan rudiments.
In de aanpak comprimeren we het weefsel voorzichtig tussen een glazen afdekbrief en een doorlaatbaar membraan. Hier laten we zien hoe de op maat ontworpen platen worden gemaakt en hoe de cultuurexperimenten worden opgezet. Zo presenteren we in deze publicatie een verbeterde nierorgelslangcultuurtechniek.
Deze methode biedt een betere manier om organelle genesis model en voeren hoge resolutie beeldvorming om embryonale nieren en nierorganoïden ex vivo studie. Afhankelijk van uw experiment nemen overdracht cel contra-inserts ontworpen voor zes-put of 12-well platen. Snijd de zijkanten van de wisselplaat met behulp van een Dremel gereedschap om een twee millimeter hoge plastic ring te maken met een doorlaatbaar membraan eraan vast.
Poets de randen van de ring van swarf met een scalpel of een scherp mes. Steriliseer de minireservoirs minstens een uur in 70%ethanol. Was vervolgens de minireservoirs in autoclave door gedestilleerd water en droog ze in een laminaire kap.
Spoel de minireservoirs af in PBS en cultuurmedium. Plaats het reservoir op een petrischaaltje bovenop ons valmedium met het membraan naar boven gericht. Schik ontleed ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden op het membraan.
Vermijd het verlaten van veel vloeistof rond de monsters en laat ze bevestigd van twee tot 24 uur in een cel cultuur incubator. Exenal transplantatie wordt gedaan om het chorioallantoïsche membraan van acht dagen oude ex ovo embryonale kip. Breng de minireservoirs zo over dat het membraan het transplantaat bedekt.
Plaats ze in de periferie van de CAM, zodat ze het embryo niet bedekken. Voeg vervolgens cultuurmedium toe aan de minireservoirs. Cultiveren van de monsters op kip CAM voor maximaal.
Vervang dagelijks het kweekmedium in de minireservoirs. Vascularisatie van de monsters kan al 24 tot 48 uur na transplantatie worden waargenomen. Om de op maat ontworpen zes-put platen voor de vaste cultuur te maken.
Je moet beginnen met het boren van 20 millimeter gaten in de bodem van de plaat met behulp van een boormachine met een geschikte boorbit. Poets vervolgens de velgen van de gaten aan de bovenzijde van de plaat. Steriliseer ten slotte de platen gedurende ten minste een uur in 70%-ethanol.
Was vervolgens de platen in autoclave door gedestilleerd water en droog ze in lemiar kap. Was de 22x22 millimeter afdekking in 70% ethanol en laat ze volledig drogen. Lijm de cover slip op de top van een gat in de bodem van een put met behulp van weefsellijm.
Inspecteer na het drogen de platen onder steriele microscoop en verwijder de overtollige lijm. Meng eerst een aliquot van polystyreenkralen met een gelijk volume waterstof. Plaats de doorvulinzet onder een ontledenmicroscoop met membraan naar boven en schik de nieren op het membraan.
Voeg een druppel hydro-gel kraal mengsel naast de nieren zorgvuldig. Draai de transfill insert zodat het membraan en de nieren naar beneden gericht zijn. Plaats vervolgens voorzichtig de insert in onze put van op maat ontworpen zes-put plaat.
Duw de wisselplaat heel voorzichtig in de put. Volg de mate van afvlakking van de microscoop tot de nier op het niveau is met de kralen. Houd de wisselplaat lichtjes ingedrukt op de put met een hand en bevestig het aan de plaat door het smelten van plastic op drie punten aan de periferie van de insert met een soldeerbout.
Voeg twee milliliter cultuurmedium in de put door middel van een opening aan de zijkant. Bij het starten van een time-lapse beeldvorming, breng de plaat in de on-stage incubator van een omgekeerde microscoop. Ons gemodificeerd CAM capture protocol maakt zeer efficiënte vascularisatie van nierorganoïden en embryonale nieren mogelijk.
Veel reservoirs met kweekmedium levert donorweefsel en beschermen het tegen drogen tijdens de eerste periode van tijd die het vascularizaton voert. Deze film toont de stroom van kippenbloedcellen in een embryonale muis niercentrum geënt om kip CAM en gekweekt voor zeven dagen. Dit cijferpaneel laat zien dat onze verbeterde CAM-kweekmethode tolerante omstandigheden biedt voor de nierafgeïnlaten endotheelcellen.
Cijfers A en B tonen embryonale nieren geteeld voor vijf dagen op dagen interval cultuur werden centrum geënt om kip CAM voor vijf dagen. Vlekken met muisspecificaties CD-31-antilichaam toont aan dat het endotheelcelnetwerk van het niercentrum geënt is aan CAM uitgebreider is dan in de controle aan de linkerkant. In figuur C zien we dat muisbloedvaten bevlekt met muisspecifieke CD-31 antilichaam en dat is het meest met kip bloedvaten.
Figuren D en E tonen cryosections van muis embryonale nieren geteeld op reiscultuur of kip CAM voor vijf dagen en gekleurd met CD-31 en Hoechst. De glomeruli vasculatuur is rijper in nieren gekweekt op kip CAM dan in controleculturen. Figuur F toont zeven dagen lang een embryonale nier van een muis die op CAM van een transgene GFP-kip wordt gekweekt.
De muis endotheelcellen zijn gekleurd met CD-31 antilichaam en we kunnen vaststellen dat de vasculatuur in xenotransplantatie muis nieren is meestal maar niet uitsluitend muis afgeleid. De nieuwe vaste reeksrichtingscultuur maakt het kweken van embryonale nieren en organoïden in een beperkte vastgestelde afstand mogelijk. In een traditionele reiscultuur worden de gekweekte organen op een filter geplaatst dat door een metalen raster in een luchtmediuminterface wordt bewaard.
Deze methode zorgt voor goede omstandigheden voor de ontwikkeling en groei, maar is niet optimaal voor beeldvorming. In de vaste richting cultuur, wordt het gekweekte orgaan gedrukt tussen een glazen bodem van de schotel en een membraan en de dikte ervan wordt gecontroleerd door de polystyreen kralen werken als afstandhouders hier. De zich ontwikkelende organen kunnen direct door het afdekglas worden afgebeeld, waardoor het zicht op het orgel wordt verbeterd.
Dit cijferpaneel laat zien dat de embryonale nieren en nierorganoïden kunnen worden gekweekt in de vaste richting cultuurmethode. Heldere veldbeelden van embryonale nieren en nierorganoïden op dag zeven laten een normale ontwikkeling zien. In figuur C is de GFB-expressie geactiveerd in de zich ontwikkelende nefrons van een nierorganoïde door figuur D toont een nier met trauma één kleuring op de euretric knop en zes twee kleuringen die de nephron voorloper cellen markeren.
De cijfers E en F presenteren de muisnier die 12 dagen wordt gekweekt. Trauma één en nephron het bevlekken tonen de eurethric knop en podocites. De film ook, presenteert een embryonale nier van MTMG, Taiwan cree oorsprong, waar de Taiwan cree induceert GFB expressie in endotheelcellen.
We kunnen zien dat de nierendotheelcellen aanwezig zijn in de zich ontwikkelende embryonale nier en het endotheelnetwerk zich ook in de kweekmethode kan ontwikkelen. In het paneel aan de rechterkant u zien hoe endotheelcellen migreren naar de vasculaire spleet van een S-vormige faseneveron. Hier hebben we het verbeterde protocol voor xenotransplantatie van nierorganoïden en embryonale nieren gepresenteerd aan kip CAM.
Dit protocol verhoogt aanzienlijk de overleving van nier rudiments en ook hun intrinsieke endotheelcellen. De methode maakt de bloedtoevoer naar de zich ontwikkelende glomerulus. Het andere protocol dat hier wordt gepresenteerd is de vaste richting orgaancultuur methode die de beeldkwaliteit verbetert en helpt om organelle genesis studie op het niveau van eencellige.
De hoge resolutie beelden zijn geschikt voor geautomatiseerde celsegmentatie en computergebaseerde studie van cellulair gedrag in nierorganoïden en nierculturen.
Tags
Ontwikkelingsbiologie nummer 157 nier- en orgaancultuur time-lapse organoïde beeldvorming kuiken CAM kippenembryo chick ex ovo cultuur vascularisatie xenotransplantatieRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
