Dette arbeidet beskriver to metoder for å studere organutvikling, et forbedret xenotransplantasjonsoppsett på chorioallantoic membran (CAM) fra fugleembryoer som gjør det mulig for vaskularisering av kultiverte embryonale organer og organoider og en ny fast z-retning organkulturmetode med modifiserte eksperimentelle forhold som gjør det mulig å høyoppløsnings tidsforløp konfokal avbildning.
Embryonale nyreorganotypic kulturer, og spesielt pluripotent stamcelle-avledet nyre organoider, er gode verktøy for å følge utviklingsprosesser og modellering nyresykdom. Modellene er imidlertid begrenset av mangel på vaskularisering og funksjonalitet. For å løse dette ble det utviklet en forbedret protokoll for metoden for xenograftingceller og vev til chorioallantoic membranen (CAM) av et fugleembryo for å få vaskularisering og restaurering av blodstrømmen. Grafts er overlaid med skreddersydde minireservoarer som fikser prøvene til CAM og forsyner dem med kulturmedium som beskytter grafts fra tørking. Den forbedrede kulturmetoden gjør det mulig for xenografts å vokse i opptil 9 dager. Manuskriptet beskriver også hvordan man kan gi optimale forhold for langsiktig konfokal avbildning av nyreorganoider og organotypic kulturer ved hjelp av den tidligere publiserte Fixed Z-Direction (FiZD) metoden. Denne metoden komprimerer forsiktig et embryonisk organ eller organoid mellom en glasscoverslip og membran i en stor mengde medium og gir gode forhold for avbildning i opptil 12 dager. Sammen tillater disse metodene vaskularisering og blodstrøm til nyreorganoider og organotypic nyrekulturer med forbedret konfokal avbildning. Metodene som er beskrevet her er svært gunstige for å studere grunnleggende og anvendte funksjoner av nyrer ex vivo. Begge metodene gjelder for ulike typer vev og organoider.
Organotypic kultur av embryonale nyrer ble en viktig modell for å studere nefrogenesis tiår siden1,2,3. Nyreorganoider representerer et avansert modellsystem for å studere utvikling av friske og syke nyrer4. Den viktigste ulempen for begge metodene er imidlertid at ingen av metodene rekapitulerer nyrens hovedfunksjon: blodfiltrering. Nephrons og nyrevaskulatur utvikler seg i nyreorganoider og organotypic kulturer på samme måte som tidlig stadium in vivo utvikling; Imidlertid forblir glomeruli dannet in vitro avaskulær5. Vaskelse av ex vivo embryonale nyrer og nyreorganoider ble tidligere vist i transplantasjonseksperimenter bare under in vivo-forhold. For eksempel tillater transplantasjon av humane pluripotente stamcelleavledede nyreorganoider under en musnyrekapsel utvikling av nefronene i organoiden til et funksjonelt stadium6.
En mellomliggende tilnærming mellom rent in vitro kulturer og in vivo transplantasjon metoder er xenotransplantasjon til CAM av fugleembryoer. Vascularization av intakt mus nyre primordia har blitt vist tidligere ved hjelp av dette systemet7,8. Det ble imidlertid også vist at nyrevaskulaturen i xenotransplantert murine nyre ble avledet fra verten endotelet, ikke graft9. Denne observasjonen reduserte signifikant potensialet til kimeiske (fugle-pattedyr) modeller av embryonal nyre for å studere utvikling av nyrevaskulaturen, fordi de eksperimentelle forholdene var ikke tillatte for overlevelsen av donor-avledede endotelceller.
Presentert i den første delen av denne protokollen er en forbedret metode for dyrking av mus embryonale nyrer på CAM av fugleegg, kombinere mikromiljøforhold av organotypic kultur og xenotransplantasjon. Den viktigste forbedringen til tidligere metoder er at i stedet for å plassere musen embryonale nyrer og nyreorganoider direkte på CAM, implantasjonområdet er overlaid med gjennomtrengelige minireservoarer fylt med kultur medium som leverer transplantert vev med næringsstoffer og beskytte den mot tørking. Suksessraten for forsøkene øker betydelig og betingelsene for utvikling av donor-avledet vaskulatur forbedres. Anvendelse av denne metoden til xenotransplant kulturer resulterer i utvikling av glomerulær vaskulatur består av endogene endotelceller fra donor nyrer.
Detaljert analyse av cellulær morfodinese er en annen viktig anvendelse av nyrekulturmodeller. Tidligere rapporterte metoder for tidsforløp bilde oppkjøp av nyrekulturer er tilstrekkelig bare for analyse av generell morfologi og mønster av embryonalnyre, men ikke for å spore individuelle celler10. Nylig ble en ny Fixed Z-Direction (FiZD) metode rettet mot høyoppløselig konfokal 3D-tidsforløpsavbildning av nyreorganoider og organotypic kulturer beskrevet11. I denne metoden komprimeres organoider og embryonale organer forsiktig mellom en glasscoverslip og en gjennomtrengelig membran av en transwell-innsats i en spesialdesignet plate til tykkelsen på prøven når 70 μm, noe som gir optimale optiske forhold for bildebehandling. I den andre delen av metodene er en detaljert protokoll for fabrikasjon av en spesialdesignet plate og oppsett av FiZD-eksperimenter for langsiktig organoid avbildning beskrevet.
To detaljerte protokoller presenteres som avgrense den klassiske renal organotypic kultur metoden, og aktivere vaskularisering, utvidet utvikling, og optimal 4D (dvs. 3D bilde og tid) avbildning av ex vivo embryonale nyrer og organoider. Denne delen fremhever de kritiske trinnene i metodene og diskuterer feilsøking.
Den betydelige forskjellen mellom andre CAM kulturmetoder og denne forbedrede kylling CAM kultur metoden er bruk av skreddersydde minireservoarer i xenografting av embryonale nyre…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet økonomisk av Suomen Akatemia (Academy of Finland) (206038, 121647, 250900, 260056; Senter for fremragende forskning 2012-2017 251314), Munuaissäätiö – Finsk nyre- og leverforening, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Den svenske kulturstiftelsen i Finland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Kreftforeningen i Finland), Det europeiske fellesskaps syvende rammeprogram (FP7/2007-2013; gi FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) og H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network “RENALTRACT” Project ID 642937. Forfatterne takker Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias og Hannele Härkman for teknisk assistanse.
Figur 3, 4 og Film 2 er gjengitt med tillatelse fra Utvikling.
Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
Ethanol (70%) | VWR | ||
Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
Matrigel | Corning | 356230 | |
On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |