אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת

תרבות איברים בכליות ואברונים שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מספקים דרכים מצוינות ללמוד מנגנונים מאחורי התפתחות הכליות ומחלות. מערכת תרבות האיברים הנוכחית אינה מספקת זרימת דם לכליות, עם זאת. בשל כך, הסיבה שהמודלים הנוכחיים אינם שלמים ולא מצליחים לסכם מחדש את הפונקציה העיקרית של הכליה, שהיא סינון דם.

בפרסום זה, אנו מציגים פרוטוקול משופר לטיפוח והדמיה של כליות עוברי אורגנואידים על הממברנה הכוריואלנטואית של עובר העוף. בהגדרת הניסויים החדשנית שלנו, אנו כיסוי בסיסי הכליה מושתלים על CAM עם מאגרי משמעות חדירים כי הם מלאים בינוני תרבות. פרוטוקול זה מגביר באופן משמעותי את ההישרדות של היסודות הכליות וגם את תאי האנדותל המהותיים.

השיטה מאפשרת זרימת דם לגלומרולוס המתפתח. לאחרונה פרסמנו גם שיטת תרבות איברים חדשנית בכיוון קבוע המציעה הדמיה תלת-ממדית תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה. השיטה סיפקה תנאים אופטימליים להדמיה קונפוקרטית ארוכת טווח של האורגנואידים ויסודות האיברים.

בגישה, אנו דוחסים בעדינות את הרקמה בין תלוש כיסוי זכוכית לבין קרום חדיר. כאן אנו מראים כיצד מיוצרים הלוחות המעוצבים המותאמים אישית וכיצד מוגדרים ניסויי התרבות. לכן, בפרסום זה אנו מציגים טכניקה משופרת תרבות צינורות כליות.

שיטה זו מציעה דרך טובה יותר מודל organelle בראשית ולבצע הדמיה ברזולוציה גבוהה ללמוד כליות עובריות אורגנואידים כליות ex vivo. בהתאם לניסוי שלך לקחת תא העברה contra-inserts המיועדים שש בארות או 12 בארות צלחות. צמצם את דפנות ההוספה באמצעות כלי דרמל ליצירת טבעת פלסטיק בגובה שני מילימטרים עם קרום חדיר המחובר אליה.

ללטש את קצות הטבעת מן swarf עם אזמל או סכין חדה. מעקרים את המיני מאגרים ב-70% אתנול למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן לשטוף את מאגרי מיני autoclave על ידי מים מזוקקים ולייבש אותם ברדס למינאר.

יש לשטוף את המיני מאגרים ב-PBS ובמדיום התרבות. מניחים את המאגר על צלחת פטרי על גבי טיפת מדיום התרבות שלנו עם הממברנה הפונה כלפי מעלה. מסדרים כליות עובריות לשעבר של vivo או אורגנואידים בכליות על הממברנה.

הימנעו מלהשאיר נוזלים גדולים סביב הדגימות ולהשאיר אותם מחוברים בין שעתיים ל -24 שעות באינקובטור של תרבות התא. השתלת גולגולת נעשית לממברנה הכוריואלנטואית של עוף עוברי לשעבר בן שמונה ימים. מעבירים את מאגרי המיני כך שהקרום מכסה את השתל.

מקם אותם בפריפריה של CAM, כך שהם לא מכסים את העובר. לאחר מכן הוסיפו מדיום תרבות למאגרי המיני. לטפח את הדגימות על עוף CAM במשך תשעה ימים מקסימום.

החלף את מדיום התרבות במאגרים הקטנים מדי יום. כלי דם של הדגימות ניתן לראות כבר 24 עד 48 שעות לאחר ההשתלה. כדי להפוך את מותאם אישית מעוצב שש בארות צלחות לתרבות קבועה.

אתה צריך להתחיל על ידי קידוח 20 חורים מילימטר בחלק התחתון של הצלחת באמצעות מכונת קידוח עם קצת מקדחה מתאימה. לאחר מכן, ללטש את חישוקי החורים בצד העליון של הצלחת. לבסוף, לעקר את הצלחות ב 70% אתנול לפחות שעה אחת.

לאחר מכן לשטוף את הצלחות autoclave על ידי מים מזוקקים ולייבש אותם ברדס lemiar. לשטוף את 22×22 מילימטר מכסה מחליק 70% אתנול ולתת להם להתייבש לחלוטין. הדבק את החלקת הכיסוי על גבי חור בתחתית באר באמצעות דבק רקמה.

לאחר הייבוש, לבדוק את הצלחות תחת מיקרוסקופ סטרילי ולהסיר את הדבק עודף. ראשית, מערבבים aliquot של חרוזים פוליסטירן עם נפח שווה של מימן. מניחים את מוסיף המשדר מתחת למיקרוסקופ ניתוח עם קרום הפונה כלפי מעלה ומסדרים את הכליות על הממברנה.

מוסיפים טיפה של תערובת חרוזים הידרו-ג’ל ליד הכליות בזהירות. הופכים את המשדר כך שהמברנה והכליות פונות כלפי מטה. ואז בזהירות למקם את הכנס לתוך הבאר שלנו של צלחת מעוצבת אישית שש באר.

לדחוף את הכנס בעדינות רבה לתוך באר. בצע את מידת השטחה מן המיקרוסקופ עד הכליה היא ברמה עם חרוזים. שמור את הכנס מעט לחוץ לתוך באר ביד אחת ולתקן אותו לצלחת על ידי המסת פלסטיק בשלוש נקודות בפריפריה של הכנס עם ברזל הלחמה.

מוסיפים שני מדיום תרבות מיליליטר לתוך באר דרך פתח בצד. כאשר מתחילים הדמיה לשגות זמן, להעביר את הצלחת לתוך החממה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. פרוטוקול לכידת CAM המשונה שלנו מאפשר כלי דם יעילים ביותר של אורגנואידים בכליות וכליות עובריות.

מאגרים רבים המכילים תרבות בינונית מספקים רקמת תורם ומגינים עליה מפני ייבוש במהלך התקופה הראשונית של תהליך vascularizaton. סרט זה מראה את הזרימה של תאי דם עוף במרכז כליות עכבר עוברי מושתל CAM עוף מתורבת במשך שבעה ימים. לוח איור זה מראה כי שיטת תרבות CAM המשופרת שלנו מספקת תנאים מתירניים לתאי ה אנדותל שמקורם בכליות.

איורים A ו-B מראים שהכליות העובריות שגדלו במשך חמישה ימים בימים של תרבות מרווחים היו במרכזן של מצלמות עוף במשך חמישה ימים. כתמים עם פרטי העכבר CD-31 נוגדן מראה כי רשת התאים אנדותל של מרכז הכליות מושתל CAM הוא נרחב יותר מאשר בשליטה בצד שמאל. איור C אנו רואים כי כלי הדם של העכבר מוכתמים בנוגדן CD-31 ספציפי לעכבר וזה הכי הרבה עם כלי דם עוף.

איורים D ו- E מראים קריוסקופים של כליות עובריות עכבר גדל על תרבות הנסיעות או עוף CAM במשך חמישה ימים מוכתם CD-31 ו Hoechst. כלי הדם גלומרולי הוא בוגר יותר בכליות מתורבתות על עוף CAM מאשר בתרבויות שליטה. איור F מראה כליה עוברית של עכבר בתרבות CAM של תרנגולת GFP מהופנטת במשך שבעה ימים.

תאי אנדותל העכבר מוכתמים בנוגדן CD-31 ואנחנו יכולים להבחין כי כלי הדם בכליות העכבר xenotransplanted הוא בעיקר אבל לא רק העכבר נגזר. תרבות הכיוון הקבועה של הרומן מאפשרת פולחן של כליות עובריות ואורגנואידים במרחק מוגדר מוגבל. בתרבות הנסיעות המסורתית, האיברים התרבותיים ממוקמים על מסנן שנשמר בממשק בינוני אוויר על ידי רשת מתכת.

שיטה זו מאפשרת תנאים טובים להתפתחות ולצמיחה אך אינה אופטימלית להדמיה. בתרבות הכיוון הקבועה, האיבר התרבותי נלחץ בין תחתית זכוכית של המנה לבין קרום והעובי של זה נשלט על ידי גם כאן כמרחבים. האיברים המתפתחים ניתן לדמיין ישר דרך זכוכית הכיסוי נותן את התצוגה המשופרת של האיבר.

פאנל איור זה מראה כי הכליות העובריות ואיברנואידים בכליות יכולים להיות מתורבתים בשיטת תרבות הכיוון הקבוע. תמונות שדה בהירות של כליות עובריות ואיברנואידים בכליות ביום השביעי מראות התפתחות תקינה. איור C, ביטוי GFB הופעל בנפרון המתפתח של אורגנואיד בכליות על ידי איור D מראה כליה עם טראומה אחת מכתימה על ניצן euretric ושש שתיים כתמים סימון תאי מבשר נפרון.

הדמויות E ו- F מציגים את כליות העכבר בתרבות במשך 12 ימים. הטראומה 1 וכתמי נפרון מראים את ניצן הנויר ואת הפודוציטים. הסרט גם, מציג כליה עוברית של MTMG, מקור cree טייוואן, שם cree טייוואן גורם ביטוי GFB בתאי אנדותל.

אנו יכולים לראות כי תאי אנדותל הכליה נמצאים בכליה העוברית המתפתחת ואת הרשת אנדותל יכול להתפתח גם בשיטת התרבות. בלוח מימין, ניתן לראות כיצד תאי אנדותל נודדים לתוך שסוע כלי הדם של נפרון שלב בצורת S. כאן הצגנו את הפרוטוקול המשופר עבור xenotransplantation של אורגנואידים כליות וכליות עובריות כדי עוף CAM.

פרוטוקול זה מגביר באופן משמעותי את ההישרדות של היסודות הכליות וגם את תאי האנדותל המהותיים שלהם. השיטה מאפשרת זרימת דם לגלומרולוס המתפתח. הפרוטוקול השני המוצג כאן הוא שיטת תרבות האיברים בכיוון קבוע המשפרת את איכות ההדמיה ומסייעת ללמוד את בראשית האורגן ברמת התא הבודד.

התמונות ברזולוציה גבוהה מתאימות לפיגמנטציה אוטומטית של תאים ולחקר מבוסס מחשב של התנהגות תאית באורגנואידים של כליות ותרבויות כליות.